應(yīng)用SNP array檢測(cè)流產(chǎn)物三倍體

黃偉偉 胡蓉 楊曦 盧建*

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511400；2. 廣州體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)輔助器具設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510500；3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

自然流產(chǎn)在臨床妊娠較為常見，文獻(xiàn)報(bào)道自然流產(chǎn)在流產(chǎn)人群中占 10%～15%，多數(shù)為早期流產(chǎn)，其中2次及上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為 2.2%～4.0%[1,2]。50%～60%的妊娠早期流產(chǎn)是由于早期胚胎的染色體異常所致[1,2]。染色體異常主要包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，數(shù)目異常主要表現(xiàn)為染色體非整倍體和整倍體。在早期流產(chǎn)中三倍體出現(xiàn)的頻率僅次于16-三體[2]，有文獻(xiàn)報(bào)道早期絨毛、中期羊水、活產(chǎn)新生兒中出現(xiàn)頻率分別為 8/10 000、4/10 000及1/50 000[3]。

隨著技術(shù)進(jìn)步，染色體微陣列技術(shù)(CMA)逐漸用于臨床檢測(cè)。本文應(yīng)用CMA中的SNP array技術(shù)對(duì)臨床 397 例自然流產(chǎn)組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果為三倍體的病例進(jìn)行回顧性分析，以比較SNP array、array CGH兩種基因芯片在流產(chǎn)物三倍體的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年6月至2017年10月期間于廣東省婦幼保健院就診，經(jīng)臨床確診為自然流產(chǎn)的患者共397例?；颊吣挲g在16～54歲之間，平均年齡(30.5±5.4)歲。所有行 CMA 檢測(cè)的患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 顯微鏡下從流產(chǎn)物中挑取絨毛，使用QIAGEN公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 SNP array檢測(cè) 用美國(guó)昂飛公司生產(chǎn)的cyto750k SNP基因芯片進(jìn)行SNP array檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括：限制性內(nèi)切酶酶切、連接、PCR擴(kuò)增、片段化、標(biāo)記、芯片雜交、洗站洗滌芯片和芯片掃描。使用chromosome Analysis Suite(ChAS，version2.1)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，參照DECIPHER、ClinVar、OMIM、DGV等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行判讀[4]。

1.2.3 QF-PCR檢測(cè) 利用QF-PCR對(duì)SNP array結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。QF-PCR 技術(shù)通過(guò) STR 位點(diǎn)檢測(cè)常見非整倍體 13、18、21、X 和 Y[5]。PCR 反 應(yīng) 體 系 25 μl: PCR mastermix 12.5 μl，Primer mix 7 μl，DNA樣品 5.5 μl(10～30 ng)，PCR程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 20 min 。設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上ABI3500 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，然后用 GeneMaker(version2.2.0)軟件數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 array CGH檢測(cè) 對(duì)確定為69, XXY和69, XXX三倍體結(jié)果的流產(chǎn)物標(biāo)本，使用安捷倫公司生產(chǎn)的SurePrint G3 Human CGH 8x60K 微陣列芯片進(jìn)行array CGH檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括：酶切、標(biāo)記、純化、芯片雜交、芯片洗滌和芯片。使用Workbench Lite Edition7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，

2 結(jié)果

397例自然流產(chǎn)組織標(biāo)本中共檢測(cè)出8例三倍體，3例69,XXY，4例69,XXX，1例亞三倍體68,XX。由于正常的二倍體SNP array分析結(jié)果只有3條SNP散點(diǎn)帶，而69,XXX三倍體結(jié)果圖中可見4條SNP散點(diǎn)帶(圖1)，提示三倍體常染色體有4條SNP散點(diǎn)帶。圖2為1例母體污染的SNP array分析結(jié)果則有5條SNP散點(diǎn)帶。對(duì)提示為三倍體的標(biāo)本，我們用QF-PCR 進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，可以看出每個(gè)STR位點(diǎn)有3個(gè)峰面積大致相等的峰或者兩個(gè)峰面積大致1∶2(2∶1)峰，提示13、18及21號(hào)染色體確實(shí)為三體。對(duì)69,XXY三倍體array CGH檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，從圖上我們只能看出X/Y性染色體異常，而69,XXX三倍體array CGH檢測(cè)軟件顯示結(jié)果正常。

3 討論

染色體微陣列分析主要使用的是微陣列比較基因組雜交芯片(array CGH )和單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP array)。兩者均能檢測(cè)出染色體拷貝數(shù)變異，但SNP array有單核苷酸多態(tài)性探針，除了能夠檢出染色體拷貝數(shù)變異外，還能檢出純合狀態(tài)(AOH)、單親二體(UPD)和三倍體、一定比例嵌合等[6]。本文分別用SNP array、array CGH基因芯片對(duì)流產(chǎn)物三倍體檢測(cè)，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

引起自然流產(chǎn)的常見因素有年齡、遺傳、內(nèi)分泌因素以及解剖的異常等[7]。胎兒染色體異常是引起自然流產(chǎn)最主要的因素，常見的異常染色體有三倍體、多倍體、染色體單體和三體、結(jié)構(gòu)異常等，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者流產(chǎn)物染色體異常發(fā)生率較高。本文應(yīng)用SNP array技術(shù)對(duì)臨床 397 例自然流產(chǎn)組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出8例三倍體，用QF-PCR對(duì)這8例樣本進(jìn)行驗(yàn)證， 與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。array CGH技術(shù)不能對(duì)三倍體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于69,XXY三倍體array CGH檢測(cè)只能提示X/Y性染色體異常，對(duì)于69,XXX三倍體array CGH檢測(cè)顯示為46,XX正常；另外array CGH也不能對(duì)母體污染進(jìn)行有效的鑒別，特別是當(dāng)胎兒標(biāo)本為46,XX時(shí),母體污染容易忽略。

圖1 SNP array結(jié)果分析圖(69,XXX)

圖2 SNP array母體污染結(jié)果分析圖

圖3 QF-PCR結(jié)果分析圖

圖4 array CGH結(jié)果分析圖(69, XXY)

三倍體在流產(chǎn)胚胎中比較常見，有文獻(xiàn)報(bào)道三倍體在早期流產(chǎn)中占6.99%[8]。三倍體在早期自然流產(chǎn)中常見，很少在妊娠中期看到，只有極個(gè)別患兒出生，一般出生者都是三倍體的嵌合體[9]。三倍體胎兒染色體總數(shù)為69條，發(fā)生機(jī)制可分為雙雄受精、雙雌受精和正常受精后有絲分裂障礙3種。臨床常見的是雙雄受精和雙雌受精。雙雄受精是指一個(gè)正常的卵子同時(shí)與兩個(gè)正常的精子發(fā)生受精。雙雌受精是指一個(gè)二倍體的異常卵子與一個(gè)正常的精子發(fā)生受精，從而產(chǎn)生一個(gè)三倍體的合子，稱為雙雌受精。有文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)源于父親者(雙雄受精)染色體核型為69,XXY (占60%) 或 69,XYY(占 3%); 來(lái)源于母親者(雙雌受精)染色體核型為 69,XXX(占37%)[10]。本文中69,XXY檢測(cè)出3例(占37.5%)，69,XXX檢測(cè)出4例(占50%)，與文獻(xiàn)中所占比例有所不同，可能與文獻(xiàn)報(bào)道的孕周不一致所致[11]。

受基因組印跡的影響，父源或母源性三倍體兩者臨床表現(xiàn)有所不同。父源性三倍體型其臨床特點(diǎn)為：胎兒生長(zhǎng)相對(duì)良好，頭部大小成比例，頸部透明層增厚，囊狀大胎盤，面部或顱腦畸形，胎兒手足異常等，約50%以上胎兒表現(xiàn)第3、4指并指畸形，孕婦血清β人體絨毛膜促性腺激素水平升高(β-hCG)。母源性三倍體型其臨床表現(xiàn)為：胎盤小且老化早，胎兒嚴(yán)重的不對(duì)稱性生長(zhǎng)，其頭部大小正常，但軀體細(xì)小，孕婦血清β-hCG水平下降[10,12,13]。對(duì)超聲檢查中發(fā)現(xiàn)胎兒明顯不對(duì)稱生長(zhǎng)、羊水偏少，尤其是伴有“剪刀手”樣并指的胎兒，要考慮三倍體的可能性，同時(shí)要注意胎盤情況[11]。除了上述臨床特征外，三倍體的胎兒通?；加行呐K缺陷、大腦發(fā)育異常、腎上腺和腎臟缺陷(囊狀腎)、脊髓畸形(神經(jīng)管缺陷)等。一些低比例三倍體嵌合體患兒能成長(zhǎng)至成年，但伴有發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、癲癇發(fā)作、聽力喪失和其他臨床癥狀[14]。

胚胎染色體異常是導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的最主要原因，約占50% ～60%[1,2]。對(duì)流產(chǎn)物行SNP array檢測(cè)，幾乎能夠檢測(cè)出所有種類的染色體異常，是流產(chǎn)物染色體檢測(cè)的有效手段，除了能檢測(cè)出三倍體外，還能檢測(cè)出多倍體、單體、三體、不平衡易位、染色體缺失或重復(fù)、純合狀態(tài)(AOH)等。然而CMA也有其自身技術(shù)的局限性，并不能檢測(cè)出平衡易位、倒位、插入等染色體拷貝數(shù)未發(fā)生改變的異常[15]；此外CMA也不能檢測(cè)出低比例嵌合。而傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析是細(xì)胞遺傳診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能檢測(cè)出一定比例的三倍體，但流產(chǎn)標(biāo)本易發(fā)生細(xì)菌污染，培養(yǎng)失敗的比例較高[7]，而且檢測(cè)周期長(zhǎng)，現(xiàn)在較少用于流產(chǎn)物染色體檢測(cè)。流產(chǎn)物FISH、QF-PCR檢測(cè)成本低，能對(duì)常見的引起流產(chǎn)的幾條染色體快速檢測(cè)，但只能對(duì)少數(shù)幾條染色體進(jìn)行檢測(cè)，而SNP array能實(shí)現(xiàn)對(duì)全部染色體掃描。發(fā)生自然流產(chǎn)時(shí)，流產(chǎn)物進(jìn)行染色體微陣列分析，對(duì)評(píng)估再生育風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。