水環(huán)境對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

陶瑞東，王 鑫，高欣儀，周 銀，張 劍

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023）

地衣芽孢桿菌是一種土壤中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性嗜熱菌，能分泌多種酶系，如耐高溫的堿性蛋白酶[1]、纖維素酶和半纖維素酶[2]等。該菌在廢水蛋白質(zhì)降解[3]、洗滌劑工業(yè)[4]、飼料添加劑[5]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。與其他生物（如藻類、硝化細(xì)菌等）一樣，能有效降解水體中的N（以NH4+和NO2-為主）和P[6]，以減輕水體富營(yíng)養(yǎng)化程度。由于地衣芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中要消耗大量氧氣，故能起到有效地抑制其他雜菌繁殖[2]，進(jìn)而提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

本文研究了水環(huán)境對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的影響，探討了水體中的NO3--N 濃度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖能力的影響。通過(guò)優(yōu)化水環(huán)境的條件，找到了地衣芽孢桿菌的適宜生長(zhǎng)條件，這些工作對(duì)合理利用地衣芽孢桿菌有一定的借鑒和參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

菌種：地衣芽孢桿菌，購(gòu)于落星生物工作室。

試劑：磷酸二氫鉀、葡萄糖、硝酸鉀等；其他試劑均為市售分析純。

儀器：UV-2102C 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UNICO（上海）儀器有限公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；80-2 電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；pHS-3C 酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 方法

葡萄糖含量的測(cè)定：按DNS 試劑法[7]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.178 X（mg）-0.038 4，R2=0.991 7。

HPO42-含量測(cè)定：按磷鉬藍(lán)分光光度法（GB/T 5750.5-2006）測(cè)定。具體操作如下：取菌水解液，于4 000 rpm離心10 min。取上清液0.1 mL，用蒸餾水稀釋至50 mL，加入4 mL 鉬酸銨—硫酸溶液后，再滴加一滴飽和的氯化亞錫溶液，顯色10 min,于650 nm 處測(cè)量吸光度。測(cè)定HPO42-的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.002 1 X（μg）-0.004 3，R2=0.993 4。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

保持培養(yǎng)條件（pH 為6.5；葡糖糖、HPO42-、NO3-N濃度分別為3.6 mg/mL、0.98 mg/mL、0.62 mg/mL；0.4 g/L地衣芽孢桿菌接種量）不變，測(cè)試溫度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響（見(jiàn)圖1）。研究表明，當(dāng)水環(huán)境中無(wú)時(shí)，地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用能力有限，生長(zhǎng)速率緩慢。不過(guò)，其活性仍與溫度有關(guān)，其強(qiáng)弱順序依次為37℃＞26℃＞45℃。當(dāng)存在氮源時(shí)，地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力明顯增強(qiáng)。在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖利用能力的強(qiáng)弱順序是：37℃≥45℃＞26℃。地衣芽孢桿菌在26℃時(shí)利用葡萄糖的能力弱，歸因于培養(yǎng)溫度低，導(dǎo)致生長(zhǎng)、繁殖速度過(guò)緩。然而，當(dāng)培養(yǎng)溫度升至45℃，地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力依然十分強(qiáng)勁，可以與37℃媲美。可見(jiàn)，氮源的存在，對(duì)維持地衣芽孢桿菌的熱穩(wěn)定性具有積極的作用。

2.2 NO3--N 濃度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

圖1 溫度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

圖2 NO3- 對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

為了進(jìn)一步考查NO3--N 濃度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響，保持水環(huán)境酸度（pH=6.5）、P 含量（0.98 mg/mL）不變，提高了水環(huán)境葡萄糖濃度（7.2 mg/mL）、降低了地衣芽孢桿菌的接種量（0.1 g/L），在37℃的培養(yǎng)條件下測(cè)試了NO3--N 濃度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響（見(jiàn)圖2）。研究表明，在0～20 h 的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，NO3--N 濃度幾乎不影響地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)20 h 時(shí)，水環(huán)境中的NO3--N 明顯影響地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用。當(dāng)NO3--N 濃度在0～46.7 mg/L 時(shí)，隨著NO3--N 濃度增大，地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用能力則增強(qiáng)；當(dāng)NO3--N 濃度≥46.7 mg/L，隨著NO3--N 濃度的增大，地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力減弱?？梢?jiàn)，地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖利用能力大小與水環(huán)境中的NO3--N 濃度有關(guān)。46.7 mg/L 的NO3--N 濃度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖最有利。

2.3 酸度的影響

2.3.1 酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

在37℃，葡糖糖、HPO42-、NO3--N 初始濃度分別為3.6 mg/mL、0.98 mg/mL、23.4 mg/L，活性干地衣芽孢桿菌干粉接種量為0.4 g/L 的培養(yǎng)條件下，研究了酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響（見(jiàn)圖3）。研究表明，在1天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力均較弱；培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h 后，在pH=5.0 和pH=9.0 的初始酸度培養(yǎng)環(huán)境下，地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的消耗率達(dá)95%，要獲得如此高的消耗率，pH=8.0 的培養(yǎng)條件需要3 天時(shí)間，pH=6.0 和pH=7.0 的培養(yǎng)環(huán)境需要更長(zhǎng)的時(shí)間。由此可見(jiàn)，水環(huán)境酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力影響較大。在pH=5.0（pH=9.0）時(shí)最強(qiáng)，其次是pH=8.0，pH=7.0 和pH=6.0 的水環(huán)境利用葡萄糖能力相對(duì)較弱。

圖3 酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的影響

圖4 酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用P 的影響

2.3.2 不同酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用P 的影響

在圖3 的培養(yǎng)條件下，研究了酸度對(duì)地衣芽孢桿菌利用P 的影響（見(jiàn)圖4）。研究表明，經(jīng)過(guò)6 天的培養(yǎng)，水環(huán)境中磷的變化經(jīng)歷了先增高后下降兩個(gè)階段。第一階段，經(jīng)過(guò)2 天的培養(yǎng)，pH=5.0 的初始培養(yǎng)液中的磷含量升至最大值，而其他酸度培養(yǎng)條件需3 天，這一階段是地衣芽孢桿菌進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。微生物進(jìn)入新環(huán)境，不適應(yīng)水體新環(huán)境的微生物自然死亡，釋放出磷，導(dǎo)致水體磷含量升高；第二階段，是地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水體中的磷緩慢下降。磷是構(gòu)成細(xì)胞體的核酸、磷脂和輔酶的重要組成成分，水體中磷的降低，正是地衣芽孢桿菌用于生長(zhǎng)繁殖的結(jié)果。不過(guò)，菌體對(duì)磷的需求量并不是很大，導(dǎo)致地衣芽孢桿菌對(duì)磷的利用速率緩慢。

2.3.3 酸度對(duì)生物量的影響

在與圖3、圖4 相同的培養(yǎng)條件下，地衣芽孢桿菌在水體中的生長(zhǎng)經(jīng)歷了適應(yīng)期、生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段。不過(guò)，水環(huán)境酸度不同，各階段到來(lái)的時(shí)間有別。例如，在pH=6.0 的水體環(huán)境中，達(dá)到對(duì)數(shù)期需要1 天時(shí)間；在pH=8.0 的環(huán)境，達(dá)到對(duì)數(shù)期需要48 h；pH=7.0 的水體環(huán)境，呈現(xiàn)對(duì)數(shù)期特征所需時(shí)間更長(zhǎng)。在某些培養(yǎng)環(huán)境中，適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的特征并不明顯，如在pH=5.0 培養(yǎng)時(shí)，第1 天呈現(xiàn)明顯的對(duì)數(shù)期特征，即微生物增長(zhǎng)速率呈線性遞增，經(jīng)過(guò)2 天培養(yǎng)時(shí)，生物量仍持續(xù)增大。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間與地衣芽孢桿菌生物量的關(guān)系

結(jié)合圖5，綜合考查地衣芽孢桿菌利用葡萄糖、P 的結(jié)果。接種的前2 天，地衣芽孢桿菌處于適應(yīng)期和對(duì)數(shù)期。葡萄糖維持一天的穩(wěn)定后快速下降，生物量增至最大。在對(duì)數(shù)期，菌體快速增殖，由于受水環(huán)境養(yǎng)分限制，部分菌體呈現(xiàn)死亡體征，伴隨P 的釋放，導(dǎo)致水環(huán)境P濃度增大。經(jīng)過(guò)3～5 天培養(yǎng)，地衣芽孢桿菌生物量進(jìn)入穩(wěn)定期，由于受碳源（葡萄糖）的影響，生物量呈波動(dòng)變化，水環(huán)境中的P 濃度下降正是菌體利用P 的結(jié)果。培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)入第6 天，生物量出現(xiàn)衰亡期跡象，菌體總數(shù)開(kāi)始回落。

3 結(jié)論

（1）地衣芽孢桿菌利用碳源（葡萄糖）的最適溫度為37℃。

（2）水環(huán)境NO3--N 濃度影響地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力。無(wú)NO3--N 時(shí)，地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的能力弱，46.7 mg/L NO3--N 濃度最利于地衣芽孢桿菌降解葡萄糖。

（3）地衣芽孢桿菌利用葡萄糖的最適pH 為5.0 和9.0。

（4）地衣芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中只能緩慢利用磷。