蘿卜硫素對HER2 CAR-T細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)因子分泌及抗腫瘤作用的影響

申春一，張 震，田永貴，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

基于嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)在臨床治療中的安全性及有效性，美國FDA已于2017年批準(zhǔn)其上市[1-2]。然而在細(xì)胞制備及回輸過程中，大部分CAR-T細(xì)胞分化為終末期的效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cell，Teff)，在體內(nèi)難以維持長時間的抗腫瘤效應(yīng)[3]。與Teff相比，記憶性T細(xì)胞具有強大的抗腫瘤能力，且在體內(nèi)可以長期存活及分化，有較高的臨床應(yīng)用價值[4]。記憶性T細(xì)胞包括中心記憶性T細(xì)胞(central memory T cell，Tcm)和效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cell，Tem)，其分化受到多種機(jī)制的調(diào)控，已有研究[5]表明代謝在T細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。Teff在分化為記憶性T細(xì)胞后其代謝方式由糖酵解轉(zhuǎn)化為脂肪酸氧化和氧化磷酸化，即發(fā)生了代謝重編程[6]。有研究[7]報道，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作為代謝檢查點可使糖酵解水平增加，而mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制這一過程并促進(jìn)T細(xì)胞記憶亞群的分化。作者的前期研究[8]結(jié)果也表明，抑制糖酵解或增加氧化磷酸化水平，可促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的形成。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種主要富集在十字花科植物中的天然營養(yǎng)素[9]，其對代謝有調(diào)控作用[10]，可通過影響糖異生過程控制血糖，并在2型糖尿病的治療中顯示出良好效果[11]。有文獻(xiàn)[12]表明SFN可促進(jìn)脂肪細(xì)胞褐化/脂肪酸氧化和葡萄糖有氧氧化。因此，本研究檢測SFN處理后人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)CAR-T細(xì)胞糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關(guān)酶mRNA的表達(dá)，探討SFN對HER2 CAR-T細(xì)胞分化及抗腫瘤效應(yīng)的影響和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gbico公司，人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，人CD8分選磁珠、人CD3/CD28活化磁珠購自德國美天旎公司，流式抗體購自美國Biolegend公司，Trizol、Primescript RT reagent Kit購自日本TaKaRa公司，SYBR Green qPCR Master Mix購自德國Roche公司，重組人IL-2購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司。

1.2HER2CAR-T細(xì)胞的制備及分組參考文獻(xiàn)[13]分離、獲取CD8+T細(xì)胞。采用序列合成方法將識別HER2抗原的HER2-scFv連接至CD28和CD3的信號區(qū)，再將其亞克隆入慢病毒載體中，測序驗證HER2 CAR載體構(gòu)建成功后，通過病毒包裝(293T系統(tǒng))及T細(xì)胞感染獲得HER2 CAR-T細(xì)胞(效率達(dá)到60%以上)。將HER2 CAR-T細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔1×106個，設(shè)置為對照組及SFN組(加15 μmol/L SFN)，處理72 h后進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測。

1.3兩組HER2CAR-T細(xì)胞分化的檢測收集兩組HER2 CAR-T細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-PE和CCR7-PerCP，4 ℃孵育20 min后上流式細(xì)胞儀檢測。CD45RO-CCR7+為Tn細(xì)胞，CD45RO+CCR7+為Tcm細(xì)胞，CD45RO+CCR7-為Tem細(xì)胞，CD45RO-CCR7-為Teff細(xì)胞。

1.4兩組HER2CAR-T細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)因子的檢測以A549為靶細(xì)胞，以HER2 CAR-T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按效靶比為10∶1共孵育，同時加入阻斷劑BFA(1×)。6 h后收集細(xì)胞，PBS清洗后避光加入CD8-APC-Cy7，避光4 ℃孵育20 min后固定破膜，再避光加入胞內(nèi)抗體IFN-γ-PE-Cy7和TNF-α-APC，檢測兩組細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及TNF-α的分泌水平。每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.5兩組HER2CAR-T細(xì)胞殺傷能力的檢測以A549為靶細(xì)胞，以HER2 CAR-T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，設(shè)置效靶比分別為1∶1、5∶1和10∶1，共孵育6 h。采用Annexin V和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率越高代表HER2 CAR-T細(xì)胞的殺傷能力越強。每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.6兩組HER2CAR-T細(xì)胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關(guān)基因的檢測將HER2 CAR-T細(xì)胞離心棄上清，加入1 mL Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行PCR。反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA 2 μL，SYBR GREEN染料10 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸。每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。引物及序列見表1。實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

HK2：己糖激酶2；PFKM和PFKP：磷酸果糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；CPT1A：肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)因子分泌水平、細(xì)胞殺傷能力、細(xì)胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關(guān)酶mRNA表達(dá)的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組HER2CAR-T細(xì)胞分化的比較見表2。由表2可知，與對照組相比，SFN處理后Tcm細(xì)胞比例升高。

表2 兩組HER2 CAR-T細(xì)胞分化的比較(n=3) %

2.2兩組HER2CAR-T中細(xì)胞內(nèi)因子分泌水平的比較見表3。由表3可知，與對照組相比，SFN能促進(jìn)HER2 CAR-T細(xì)胞內(nèi)因子的分泌。

表3 兩組HER2 CAR-T細(xì)胞內(nèi)因子分泌水平的比較

2.3兩組HER2CAR-T細(xì)胞對A549殺傷能力的比較見表4。由表4可知，SFN組A549凋亡率高于對照組。

表4 兩組HER2 CAR-T細(xì)胞對A549殺傷能力的比較 %

2.4兩組HER2CAR-T細(xì)胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關(guān)酶mRNA的表達(dá)結(jié)果見表5。由表5可知，經(jīng)SFN處理后，HER2 CAR-T細(xì)胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平較對照組降低，脂肪酸氧化過程相關(guān)酶CPT1A mRNA表達(dá)水平較對照組升高。

表5 兩組HER2 CAR-T細(xì)胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關(guān)酶mRNA的表達(dá)(n=3)

3 討論

SFN被看作是已知的所有天然抗癌物質(zhì)中效果最好的活性成分，在體外和體內(nèi)實驗中均證實可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[14-15]。作者的前期研究[16]發(fā)現(xiàn)SFN可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞記憶前體細(xì)胞的分化。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SFN處理后HER2 CAR-T細(xì)胞記憶性T細(xì)胞亞群分化增多，IFN-γ及TNF-α分泌水平和殺傷活性增加，提示采用SFN處理CAR-T細(xì)胞有望成為體外擴(kuò)增記憶性T細(xì)胞亞群并增強其功能的一種方法。

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞的代謝特征被稱為Warburg效應(yīng)，即在有氧條件下，腫瘤細(xì)胞也主要以無氧糖酵解的方式提供能量[17]。T細(xì)胞在靜息狀態(tài)下的代謝方式為氧化磷酸化，而經(jīng)過刺激后其代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鈁18]。CAR-T細(xì)胞也有相似的分化過程與代謝模式，如何通過調(diào)節(jié)代謝方式獲得記憶性細(xì)胞是研究的重點。目前通過調(diào)節(jié)代謝影響T細(xì)胞分化的藥物主要集中在靶向代謝檢查點的激活劑或抑制劑[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN可抑制HER2 CAR-T細(xì)胞的糖酵解途徑關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)，促進(jìn)記憶亞群的形成。但SFN調(diào)控T細(xì)胞糖酵解的具體分子機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步探究。

目前對于腫瘤患者的治療提倡采用多種手段聯(lián)合的綜合治療，CAR-T過繼回輸治療與免疫檢查點抑制劑、靶向藥物等相結(jié)合，可獲得更好的療效[21-22]。本研究結(jié)果表明，SFN不僅促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的形成，還可增強其功能，因此將CAR-T細(xì)胞與SFN聯(lián)合治療可獲得更好的抗腫瘤效果。

綜上所述，本研究在體外實驗證明了經(jīng)SFN處理后HER2 CAR-T細(xì)胞抗腫瘤功能得到增強，并揭示了SFN可能通過抑制HER2 CAR-T細(xì)胞糖酵解途徑促進(jìn)記憶亞群形成，這為CAR-T細(xì)胞與SFN聯(lián)用治療腫瘤提供了實驗基礎(chǔ)。