紫草中紫草素及衍生物的分離研究

陳江龍

【摘 要】本文紫草中紫草素及衍生物的分離研究中運(yùn)用硅膠柱層析法進(jìn)行分離，采用了300-400目硅膠填充料，設(shè)置4cm×27cm的層析柱徑高比，萃取出石油醚液提，進(jìn)行濃縮，將硅膠混勻，得到石油醚與乙酸乙醋的洗脫溶劑，采用3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。運(yùn)用高效液相色譜法，得出紫草素及其中的5種衍生物，分別是紫草素、異戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-輕基異戊酞紫草素等四種化合物。

【關(guān)鍵詞】紫草中紫草素；衍生物；分離研究

紫草中主要生物活性成分有蔡釀?lì)惢衔铮é?乙酞氧基異戊酞紫草素、紫草素、乙酞紫草素、β-β二甲基丙烯酞紫草素、異戊酞紫草素等，紫草具有良好的增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗癌、降血糖、護(hù)肝、抗菌、抗生育等多多種功效。屬于一種天然食用色素，紫草素類(lèi)化合物能夠有效抑制血小板活化因子、骨膠原、兔血小板凝聚、花生四烯酸等。單菇苯醒與單菇苯酚能夠有效抑制體外前列腺的生物合成，屬于我國(guó)傳統(tǒng)的中藥之一，對(duì)其進(jìn)行人工種植培育以及衍生物的分離研究具有重要的應(yīng)用前景。

一、實(shí)驗(yàn)

（一）實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器

本次研究選用的是從黑龍江哈爾濱三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)采購(gòu)的新疆紫草藥材，經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)鑒定為屬于新疆紫草的干燥根莖。實(shí)驗(yàn)試劑包括實(shí)驗(yàn)室自制的去離子水，中國(guó)藥品生物制品檢定所的紫草素對(duì)照品，以及甲醇與色譜純。選用的實(shí)驗(yàn)儀器有美國(guó)Waters公司的Waters高效液相色譜儀，上海玻璃儀器廠的M-50型玻璃過(guò)濾器，北京Sartorious有限公司的BS210S電子天平，日本島津公司的UV-2550紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)，江蘇常熟長(zhǎng)青儀器儀表廠的DT200A電子天平。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

將甲醇加入到紫草素對(duì)照品之中制成0.4182mg/ml的溶液，以其作為對(duì)照品貯備液。將其加入到不同容量的溶液之中，加入甲醇進(jìn)行定容，得出對(duì)照品的溶液。

制備樣品溶液，選取10g干燥紫草根粉末，將100ml90%的乙醇溶液加入其中并進(jìn)行3min的勻漿處理，之后使用漏斗進(jìn)行抽濾處理，樣本溶液即濾液，對(duì)樣本溶液采用避光冷藏保存方式。測(cè)定提取液中紫草素含量，將1ml液計(jì)量體積進(jìn)行稀釋之后得出適宜的溶液，進(jìn)行離心處理，采用的離心條件是25℃的離心溫度，設(shè)置12000r/min的速度，進(jìn)行5min的離心處理，對(duì)上清液進(jìn)行3次檢測(cè)，在55℃的溫度環(huán)境下對(duì)剩余的溶液進(jìn)行濃縮稱(chēng)重，計(jì)算其中的浸膏純度。

選取10.0g絕干條件下的新疆紫草原料，對(duì)其進(jìn)行超聲、回流、微波、冷浸以及超臨界CO2萃取，對(duì)液回收溶劑進(jìn)行充分提取，在50℃環(huán)境將溶劑除去，計(jì)算樣本中的得率與純度。在提取時(shí)間增加的情況下，紫草素得率也在隨之增加，同時(shí)起純度也呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，一般以3-5min的提取時(shí)間為宜。

二、紫草中紫草素及衍生物分離實(shí)驗(yàn)方法

（一）硅膠柱層析分離純化紫草素衍生物

首先裝柱，將300-400目硅膠在充分浸泡之下形成糊狀，之后沿著層析柱壁逐層攪拌，設(shè)置1滴/秒的攪拌速度，確保將硅膠柱壓實(shí)，并將其中的氣泡趕盡，設(shè)置4cm×27cm的層析柱徑高比。

之后上樣，在60-90℃沸程下，以石油醚6次萃取1000ml紫草80%乙醇勻漿提取液，并將其合并成石油醚萃取液，在50℃的溫度環(huán)境下，將溶液壓縮至50ml，并將10g300-400目硅膠加入其中，在層析柱表面上將拌有紫草提取物的硅膠鋪在其上，設(shè)置2cm的鋪層厚度。

之后是洗脫處理，在一定的流速之下，將不同配比的溶劑體系進(jìn)行洗脫處理，結(jié)合時(shí)間判斷流處于的具體體積，并在固定的時(shí)間內(nèi)對(duì)其進(jìn)行HPLC檢測(cè)，在石油醚：乙酸乙酷比例上設(shè)置一定的梯度進(jìn)行洗脫處理，設(shè)置3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。在流出紫草素衍生物時(shí)，將產(chǎn)品段進(jìn)行充分收集，在HPLC檢測(cè)下沒(méi)有樣本的情況下停止收集。并將收集到的紫草素衍生物洗脫液合并，并對(duì)其進(jìn)行高效液相檢測(cè)，之后對(duì)部分樣品進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。

（二）運(yùn)用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀

1.色譜設(shè)置條件

本次研究中采用高效液相色譜方法檢測(cè)，即HPLC，將流動(dòng)相：甲醇：水：乙酸之間的比例設(shè)置為82：17.5：0.5，設(shè)置5μm，4.6mm×250mm Kromasil C18的色譜柱，設(shè)置25℃的室溫，設(shè)置1.0ml/min的柱溫，設(shè)置10μL的進(jìn)樣量，以及516nm的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.采用結(jié)晶法純化紫草素

對(duì)50ml紫草乙醇提取液，將其中的乙醇回收至剩余量的20ml，之后將20ml水加入至其中。之后以50ml為限萃取3次石油醚萃，并將三次萃取結(jié)果合并，計(jì)算三次的共同體積，之后萃取三次等體積的0.2mol/LNOH，并將1mol/L的H2SO4溶液加入其中，促進(jìn)其反應(yīng)直至溶液顏色從藍(lán)色變成紅色，其中的hH值變成5-6，在室溫之下攪拌兩小時(shí)，直至能夠從溶液中析出紅色固體物質(zhì)，之后對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾、水洗，并在50℃的真空條件下干燥。選取其中一定量的樣本進(jìn)行溶解，對(duì)樣本中所含有的紫草素含量進(jìn)行測(cè)量。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）采用硅膠柱層析分離純化紫草素衍生物結(jié)果分析

采用硅膠柱層析法得到的紫草素及其衍生物中的色譜圖具體如下圖1所示。

圖1 紫草素及其衍生物中的色譜圖

按照色譜實(shí)施的條件對(duì)硅膠柱層析法中得出的紫草素及其蔡醒類(lèi)衍生物單體進(jìn)行色譜檢測(cè)，分析各個(gè)不同單體成分中的分子量，并對(duì)色譜結(jié)果進(jìn)行分析，能夠得出化合物中的物Ⅰ表示紫草素，Ⅱ表示β、輕基異戊酞紫草素，Ⅲ表示乙酞紫草素，Ⅳ表示異戊酞紫草素，同時(shí)化合物中的Ⅳ與Ⅴ成分在此次試驗(yàn)結(jié)果下尚難以充分確定。

（二）結(jié)晶法純化紫草素的結(jié)果

按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，采用結(jié)晶法純化紫草素，在此次實(shí)驗(yàn)中得到了15mg的紅色紫草素固體，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)之后，得到90%以上的紫草素純度。

四、結(jié)束語(yǔ)

本文運(yùn)用硅膠柱層析法分離紫草素衍生物過(guò)程中設(shè)置了4cm×27cm的層析柱徑高比采用了300-400目硅膠填充料，將石油醚萃取液提取出之后，對(duì)其進(jìn)行一定濃縮，并將其與定量的硅膠充分混勻，之后得到不同不同體積比石油醚與乙酸乙醋的洗脫溶劑，設(shè)置3.255ml/min的流速，分段將其流出分析。在高效液相色譜法的運(yùn)用之下，得出紫草素及其中的5種衍生物并對(duì)其采用液相-質(zhì)譜檢測(cè)，得出紫草素、異戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-輕基異戊酞紫草素等四種化合物。

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