基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的冠心寧片治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛作用機制

柴露露， 孫明月， 姚賀之， 李亞慧， 高 蕊

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院， 北京 100091）

近年來， 冠心病發(fā)病率呈逐漸上升趨勢， 嚴重威脅著人類健康。 現(xiàn)代醫(yī)學認為， 冠心病心絞痛主要是由于冠狀動脈供血不足， 導(dǎo)致心肌細胞出現(xiàn)暫時性的缺血缺氧， 從而誘發(fā)胸悶、 胸痛等臨床癥狀， 故臨床常用鈣拮抗劑、 抗血小板聚集、 擴張血管等藥物治療[1］； 中醫(yī)認為， 冠心病心絞痛屬于“胸痹” “真心痛” 范疇， 主要是由于瘀血阻滯、 肝郁氣滯、 痰濁阻滯、 陰寒凝滯， 從而導(dǎo)致心脈痹阻，發(fā)生疼痛[2］， 故活血化瘀是臨床胸痹心痛主要治法之一。

冠心寧片獲批為中藥五類新藥， 主要由丹參、 川芎組成， 攻效活血化瘀、 通脈養(yǎng)心， 丹參具有清除氧自由基、調(diào)節(jié)鈣離子代謝、 改善心肌能量代謝、 抑制血栓形成， 防止心肌梗死的作用[3］； 川芎具有清除氧自由基、 抑制血小板聚集、 抗血栓形成、 擴張冠狀動脈、 抑制血管平滑肌痙的作用[4］。 前期動物實驗發(fā)現(xiàn)， 冠心寧片具有減少心肌耗氧量、 增加冠脈流量、 清除氧自由基、 抗血小板聚集、 保護血管內(nèi)皮細胞等功能[5-7］， 臨床上主要用于治療冠心病穩(wěn)定型勞累性心絞痛Ⅰ、 Ⅱ級， 中醫(yī)辨證屬于心血瘀阻證，癥見胸痛、 唇舌紫暗等； Ⅲ期臨床試驗結(jié)果顯示， 穩(wěn)定型勞累性冠心病心絞痛患者連續(xù)服用冠心寧片12 周后， 心血瘀阻所致胸痛、 胸悶、 心悸等癥狀得到明顯改善， 而且也降低了硝酸甘油的服用量， 表明它可減輕疼痛癥狀和缺血發(fā)作， 從而改善生活質(zhì)量。 為了進一步探索冠心寧片治療穩(wěn)定型心絞痛的作用機制， 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對其主要成分治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛的作用靶點、 分子功能、生物進程、 基因通路等方面進行了分析。

1 方法

1.1 冠心寧片主要成分靶點篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP） 中， 分別檢索丹參、 川芎。 再根據(jù)MADE 原則， 以O(shè)B （口服利用度） ＞30、 DL （類藥性） ＞0.18、MW （相對分子量） ＜500 為篩選條件， 用于篩選2 味中藥的有效成分及其作用靶點。

1.2 冠心病穩(wěn)定型心絞痛相關(guān)靶點收集 以“Coronary heart disease” “Stable angina” 為檢索詞， 在Therapeutic Target Database （ TTD ）、 Drugbank、 Comparative Toxicogenomics Database （CTD） 數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將冠心病穩(wěn)定型心絞痛靶點與丹參、 川芎作用靶點進行相互映射， 通過Cytoscape3.5.1 軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析， 可得冠心寧片治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛的分子生物網(wǎng)絡(luò)。 然后， 應(yīng)用Cytoscape 軟件中的ClueGO 分析工具對相互作用的基因進行分子功能、 生物進程、 KEGG 通路分析。

2 結(jié)果

2.1 冠心寧片成分靶點篩選 共篩選出丹參中7 種有效成分， 可作用于30 個靶點； 川芎中63 種有效成分， 可作用于129 個靶點。 然后， 得到冠心病穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)靶點199 個， 發(fā)現(xiàn)冠心寧片可通過46 個靶點作用于該疾病。

2.2 冠心寧片成分-穩(wěn)定型心絞痛網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 軟件中的network analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)分析， 得到冠心寧治療冠心病穩(wěn)定型心絞痛的網(wǎng)絡(luò)圖， 見圖1。 由圖可知， 該網(wǎng)絡(luò)包括46 個節(jié)點、 601 種相互作用關(guān)系， 特征路徑長度為1.438， 網(wǎng)絡(luò)密度為0.581， 網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.432， 網(wǎng)絡(luò)密度為0.581， 網(wǎng)絡(luò)中心度為0.369， 最短路徑為2 070 （100%）， 平均相鄰節(jié)點度為26.130， 即節(jié)點之間連接度高， 特征路徑長度短， 符合小世界網(wǎng)絡(luò)的特征[8］。

2.3 分子功能、 生物學進程分析 將冠心寧片治療穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)靶點導(dǎo)入ClueGo 軟件， 進行分子功能、 生物學過程分析， 結(jié)果見圖2 ～3。 由圖可知， 冠心寧片的分子功能主要有單加氧酶活性、 磷酸酶結(jié)合等； 主要富集的生物學過程有活性氧代謝過程、 調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖、氧化氮生物合成過程、 活性氧生物合成過程、 積極調(diào)節(jié)活性氧生物合成過程等。 由此可知， 冠心寧片可通過ROS、EGFR、 IL 家族、 PPARG 等基因來治療穩(wěn)定型心絞痛， 主要體現(xiàn)在保護血管內(nèi)皮、 抗炎、 氧化應(yīng)激等。

圖2 分子功能分析

圖3 生物學進程分析

2.4 KEGG 通路分析 應(yīng)用ClueGo 軟件中的KEGG Pathways 對冠心寧片作用于穩(wěn)定型心絞痛相關(guān)靶點進行代謝通路分析， 設(shè)定P＜0.05， 結(jié)果見圖4。 由圖可知， 冠心寧片作用于穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)靶點主要富集于流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、 白介素-17 信號通路、 鞘脂信號通路、 糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號通路、 PI3K-Akt 信號通路、 AMPK 信號通路等， 本研究主要對前2 條通路進行分析， 見圖5～6。

圖4 KEGG 通路分析

3 討論

相較于西藥的單一成分、 單一靶點， 中藥及其復(fù)方具有多成分、 多途徑、 多靶點相互作用的特點， 相關(guān)研究面臨諸多困難， 網(wǎng)絡(luò)藥理學以“疾病-基因-靶點-藥物” 相互作用為基礎(chǔ)， 通過多個網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫， 對“疾病—藥物” 之間相互作用關(guān)系進行分析， 并對可能出現(xiàn)的靶點進行預(yù)測，從而為某種藥物治療某些疾病提供可靠依據(jù)[9］。 本研究基于該方法對冠心病心絞痛進行靶點、 分子功能、 生物進程、KEGG 通 路 分 析， 發(fā) 現(xiàn) 它 可 通 過VEGF、 ROS、 EGFR、PPARG、 NO、 IL-2、 IL-4、 IL-6、 TNF 等靶點參與治療穩(wěn)定型心絞痛， 主要體現(xiàn)在抗氧化應(yīng)激、 抗炎、 增強剪切應(yīng)力、保護血管內(nèi)皮等方面。 其中， 氧化應(yīng)激及其過程中產(chǎn)生的過量ROS 是發(fā)生動脈粥樣硬化的一個重要促進因素[10］；血清磷酸酶水平與反映冠脈鈣化病變嚴重程度呈相關(guān)性，而血管壁鈣化則表示動脈粥樣硬化情況出現(xiàn)[11］； VEGF 由血管內(nèi)皮細胞分泌， 是一種強烈的促血管新生的細胞因子，可增加微血管與小靜脈血管的通透性， 促進血管新生， 從而改善心肌缺氧， 緩解心絞痛[12］； 作用于血管內(nèi)皮細胞表面的流體剪切應(yīng)力增加可導(dǎo)致細胞內(nèi)NOS 活性顯著升高[13］； NO 具有抑制血小板聚集、 舒張血管、 清除氧自由基、 保護細胞的作用[14］； 近年來大量證據(jù)顯示炎癥參與冠心病心絞痛， 可能引起局部血管內(nèi)皮激活， 粥樣斑塊產(chǎn)生破裂， 繼而形成血栓或發(fā)生破裂， 導(dǎo)致心絞痛和心肌梗死的發(fā)生[15］， TNF-α 通常在炎癥反應(yīng)早期出現(xiàn)， 通過影響血管內(nèi)皮功能和血管重建來調(diào)節(jié)動脈粥樣斑塊及冠心病發(fā)生發(fā)展， 在細胞功能調(diào)節(jié)、 免疫、 炎癥反應(yīng)等過程中起著重要作用[16］。

圖5 流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化

圖6 白介素-17 信號通路

冠心寧片治療穩(wěn)定型心絞痛的作用機制主要為通過促進受損傷的心肌細胞分泌與釋放血管生長因子， 保護血管內(nèi)皮細胞， 增加血液灌流量； 抑制活性氧過量產(chǎn)生， 清除氧自由基， 滿足機體對氧的需求； 增強血液流體剪切應(yīng)力，加快血流速度， 減少血管斑塊形成； 減緩炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展。 網(wǎng)絡(luò)藥理學可用于分析藥物治療疾病的作用機制， 并從中獲得起關(guān)鍵作用的靶標或靶點， 為后續(xù)研究提供方向與科學依據(jù)， 使相關(guān)實驗／試驗更具針對性， 從而節(jié)省研究的人力、 物力， 它是基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)理論， 對未知或已知的藥物或疾病進行網(wǎng)絡(luò)分析， 從而得出藥物與疾病之間的關(guān)系， 為新藥研制及藥物創(chuàng)新提供新思路。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度闡述了冠心寧片治療穩(wěn)定型心絞痛的作用機制， 為臨床相關(guān)治療的有效性提供理論基礎(chǔ)， 也為研究成分、 靶點復(fù)雜的中藥及復(fù)方提供借鑒。