蛇床子素對冠脈結(jié)扎致心肌梗死大鼠的影響

王 皓， 李素敏， 蘭本超， 王少學(xué)， 李景昉， 孫永琨

（1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2. 河南省原陽縣人民醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453500；3. 河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室， 河南 新鄉(xiāng) 453003）

急性心肌梗死是一種嚴重的缺血性疾病， 也是導(dǎo)致死亡的常見原因之一[1］， 它由冠狀動脈供血和心肌需求不平衡所造成。 心肌壞死和功能不全的臨床標志包括血壓、 心律、 心電圖改變及左室功能障礙， 同時伴有血清心臟特殊蛋白升高。 心肌梗死不僅給患者帶來極大痛苦， 同時也給家庭和社會帶來很大的負擔(dān)， 故對該類疾病的防治是刻不容緩的重大課題。

Notch 信號通路被證實參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程，其蛋白至少有5 種Notch 配體（Jagged1～2、 Delta1～3） 和4 種Notch 受體（Notch1 ～4）[2］， 參與梗死愈合和心臟修復(fù)[3-4］， 心肌損傷后其激活對心肌具有保護作用。 另外，Notch 信號通路可通過Hes 1 信號來轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激活缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-α）[5］， 后者是心肌梗死后缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[6］， 對氧的動態(tài)平衡起著關(guān)鍵作用， 在心肌中由于缺氧和氧化應(yīng)激反應(yīng)增加而激活的該因子對心臟起著保護作用[7］。

蛇床子素是從蛇床子中提取出的主要活性成分， 能增強Notch1 信號通路活性， 減少大腦中動脈缺血再灌注所致的腦梗塞， 同時減輕海馬神經(jīng)元損傷和凋亡[8］； 對大鼠心肌急性缺血／再灌注損傷也具有保護作用[9-10］， 并能減輕心肌梗死后心肌缺血[11］， 但該成分對急性心肌梗死后心肌損傷保護作用的具體機制， 尤其是其心臟保護作用與Notch 1信號通路之間的關(guān)系尚不明確。 因此， 本實驗通過結(jié)扎大鼠心臟左前降支制備急性心肌梗死模型， 觀察蛇床子素對大鼠心臟的保護作用， 并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wistar 大鼠48 只， 體質(zhì)量200 ～250 g，雌雄各半， 由河南省實驗動物中心提供， 動物生產(chǎn)許可證號SYXK （豫） 2011-001。

1.2 儀器 HX-100 動物呼吸機、 BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）； 小動物超聲儀（森西科技有限公司）； ABI 7300 Real-Time PCR System （美國ABI公司）。

1.3 試藥 蛇床子素購自中國食品藥品檢定研究院（批號110822-200305）。 麝香保心丸購自上海和黃藥業(yè)有限公司（批號160812）。 Caspase-3、 Caspase-9 活性測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 大鼠Notch1 蛋白ELISA 試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司； 大鼠Jagged1 蛋白ELISA 試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司； BeyoRT cDNA 第一鏈合成試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后， 腹腔注射2%戊巴比妥鈉（4 mg／100 g） 麻醉， 仰臥位固定在手術(shù)板上，四肢皮下插入針電極， 連接BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)描記肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖， 經(jīng)口氣管插管， 連接小動物呼吸機。消毒手術(shù)區(qū)域， 沿左胸骨第3～4 肋間開胸， 放置眼科開瞼器制成的開胸器， 暴露心臟， 在心縮期用鑷子小心提起心包膜并剪開， 于左心耳與肺動脈圓錐間以左冠狀靜脈為標識， 左心耳根部下2～3 mm 處結(jié)扎冠狀動脈左前降支， 結(jié)扎后左室壁變蒼白， 并出現(xiàn)室壁運動減弱， 心電檢測可見Ⅱ?qū)?lián)ST 段明顯抬高， 證實結(jié)扎成功， 逐層縫合胸部切口， 關(guān)胸； 假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。 術(shù)后， 各組大鼠腹腔注射40 萬單位青霉素， 連續(xù)5 d， 以預(yù)防感染。

2.2 分組及給藥 隨機選取12 只大鼠作為假手術(shù)組， 另外取48 只建模大鼠隨機分為模型組、 陽性組及蛇床子素低、 高劑量組。 其中， 蛇床子素低、 高組分別腹腔注射該成分20、 40 mg／kg （N， N-二甲基甲酰胺、 吐溫-80、 生理鹽水按1 ∶1 ∶8 比例溶解蛇床子素， N， N-二甲基甲酰胺為溶解劑， 吐溫-80 為助溶劑， 4 ℃下保存， 使用前用生理鹽水稀釋）， 假手術(shù)組、 模型組大鼠腹腔注射同體積生理鹽水（含10%N， N-二甲基甲酰胺、 10%吐溫-80）， 陽性組大鼠灌胃麝香保心丸溶液（12 mg／kg）， 各組每天給藥1 次，連續(xù)21 d。

2.3 心電圖監(jiān)測 術(shù)前、 術(shù)后即刻及給藥1、 3、 7、 14、21 d， 大鼠麻醉， 四肢皮下插入針電極， BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)描記上述時間點的肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖， 觀察ST 段變化， 記錄S-T 段值。

2.4 超聲心動圖檢查 給藥21 d 后， 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（4 mg／100 g） 麻醉， 仰臥位固定后胸部備皮，小動物超聲儀（17.5 MHz） 進行心臟超聲檢查[12］， 項目包括左室舒張末期容積（LVEDV）、 左室收縮末期容積（LVESV）、 左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、 收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、 左室短軸的縮短率（LVFS）、 每搏量（SV）、 左心室射血分數(shù)（LVEF）。

2.5 Caspase-3、 Caspase-9 活性檢測 10 mg 缺血區(qū)心肌組織加入100 μL 裂解液， 冰浴上用玻璃勻漿器勻漿， 勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中， 冰浴后再裂解5 min， 4 ℃、16 000×g 離心10～15 min， 上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中， 立即測定Caspase 3、 Caspase-9 活性或-70 ℃下保存樣品待測， 嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作。

2.6 Notch1、 Jagged1 蛋白表達檢測 采用ELISA 法。 取缺血區(qū)心肌組織20 mg， 冰生理鹽水反復(fù)沖洗， 磷酸鹽緩沖液配置成10%勻漿， 離心后取上清液， 相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定Notch1、 Jagged1 蛋白水平， 嚴格按照說明書進行操作。

2.7 Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α、 Bax、 Bcl-2 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量法。 先按照TRIzol 試劑說明書提取缺血心肌組織總RNA， 再用紫外分光光度計測定260、 280 nm 處吸光度， 根據(jù)兩者比值檢測RNA 純度， 接著通過碧云天cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后應(yīng)用SYBR-Green 實時熒光定量試劑盒， 以cDNA 為模板， GAPDH 為內(nèi)參， 進行熒光定量PCR 擴增。 引物序列為Notch1 正 向5′-CTTCGTGCTCCTGTTCTTTG-3′， 反向5′-GCCTCTGACACTTTGAAACC-3′； Hes1 正 向5′-TCGGTGGTTACTTTGTTGCT-3′， 反 向5′-AGGCGCAATCCAATATGAAC-3′； Jagged1 正向5′-CACCCGAACTGGACAAAC-3′， 反向5′-AGCCTCAGACTGGGATAC-3′； HIF-1α 正 向5′-CAGCGATGACACGGAAAC-3′， 反 向5′-AGTGACTCTGGGCTTGAC-3′；Bax 正向5′-AGACACCTGACCTTGGA-3′， 反向5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′； Bcl-2 正向5′-AGACACCTGACCTTGGA-3′， 反向5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′， 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s， 95 ℃變性5 s， 60 ℃退火30 s，共45 個循環(huán)。 通過檢測SYBR-Green 信號強度來定量PCR產(chǎn)物， 以GAPDH 為內(nèi)參， 各基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理， 數(shù)據(jù)以） 表示， 組間比較采用單因素方差分析， 兩兩比較采用LSD 法。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠死亡情況 手術(shù)過程中及術(shù)后， 假手術(shù)組大鼠無死亡； 模型制作過程中死亡4 只大鼠（1 只死于麻醉意外，2 只死于失血性休克， 1 只死于心律失常）； 術(shù)后24 h 內(nèi)死亡2 只大鼠， 即分組前共死亡6 只大鼠， 手術(shù)成功率87.5%。 分組給藥后， 模型組大鼠又死亡1 只， 其他組大鼠無死亡。

3.2 蛇床子素對大鼠體質(zhì)量、 心臟質(zhì)量的影響 表1 顯示， 實驗結(jié)束時， 各組大鼠體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠心臟質(zhì)量、 心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較， 蛇床子素組兩者顯著降低（P＜0.01）。

表1 蛇床子素對大鼠體質(zhì)量、 心臟質(zhì)量的影響

表1 蛇床子素對大鼠體質(zhì)量、 心臟質(zhì)量的影響

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

假手術(shù)組 265.3±11.2 0.798±0.042 0.299±0.021模型組 255.4±12.2 1.153±0.052## 0.453±0.031##麝香保心丸組 258.9±11.6 0.963±0.039?? 0.373±0.029??蛇床子素低劑量組 257.1±9.8 0.992±0.055?? 0.387±0.022??蛇床子素高劑量組 259.9±10.2 0.941±0.045?? 0.362±0.026??

3.3 蛇床子素對大鼠心電圖ST 段的影響 圖1 顯示， 造模后心電圖ST 段明顯抬高； 隨著時間延長， 模型組、 蛇床子素組該值均呈下降趨勢（心肌梗死后升高的ST 段可在一定程度上自然恢復(fù)）， 以蛇床子素組更明顯。

圖1 各組大鼠心電圖ST 段

表2 蛇床子素對大鼠超聲心動圖指標的影響

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

假手術(shù)組 6.86±0.34 4.83±0.13 382.33±21.33 89.44±7.52 64.83±5.23 71.11±8.43 0.44±0.09模型組 9.83±0.45## 8.11±0.27## 474.52±31.53## 142.33±18.25## 40.12±4.23## 38.83±7.44## 0.30±0.05##麝香保心丸組 8.42±0.31?? 6.94±0.25?? 421.54±38.44?? 116.22±17.64?? 52.96±6.42?? 53.52±8.47?? 0.39±0.08?蛇床子素低劑量組 8.74±0.34? 7.62±0.18? 431.34±22.01? 127.42±13.13? 48.21±4.46? 47.52±9.21? 0.37±0.06?蛇床子素高劑量組 8.11±0.24?? 6.22±0.21?? 410.34±32.86?? 113.57±16.73?? 55.73±5.21?? 63.44±10.87?? 0.41±0.09??

3.4 蛇床子素對大鼠心電圖指標的影響 表2 顯示， 與假手術(shù)組相比， 模型組LVDd、 LVDs 顯著擴大（P＜0.01），LVEDV、 LVESV 顯著增加（P＜0.01）， LVFS、 LVEF、 SV顯著下降（P＜0.01）； 與模型組比較， 蛇床子素組LVDd、LVDs 顯著縮?。≒＜0.05， P＜0.01）， LVEDV、 LVESV 顯著下降（P＜0.05， P＜0.01）， LVFS、 LVEF、 SV 顯著增加（P＜0.05， P＜0.01）。

3.5 蛇床子素對Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表達的影響 表3 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）， Bcl-2 mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）； 與模型組比較， 蛇床子素組Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA表達顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）， Bcl-2 mRNA 表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）。

表3 蛇床子素對Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表達的影響

表3 蛇床子素對Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表達的影響

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

假手術(shù)組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 6.85±0.21## 7.15±0.31## 2.31±0.13## 0.41±0.08##麝香保心丸組 3.81±0.31?? 4.89±0.44?? 1.68±0.09?? 0.76±0.12??蛇床子素低劑量組 4.78±0.38? 5.73±0.29? 1.91±0.11? 0.61±0.11?蛇床子素高劑量組 3.34±0.25?? 3.42±0.24?? 1.32±0.12?? 0.75±0.09??

3.6 蛇床子素對Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA表達的影響 圖2 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組Notch1、HIF-1α mRNA 表達顯著增加（P ＜0.05）， Hes1、 Jagged1 mRNA 表達有所增加， 但無顯著性差異（P＞0.05）； 與模型組比較， 蛇床子素組Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA 表達顯著增加（P＜0.01）。

3.7 蛇床子素對Notch1、 Jagged1 蛋白表達的影響 圖3顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組Notch1 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）， Jagged1 蛋白表達有所增加， 但無顯著性差異（P＞0.05）； 與模型組比較， 蛇床子素組Notch1、 Jagged1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

圖2 蛇床子素對Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA 表達的影響

心肌梗死明確診斷的主要標準之一就是心電圖異常，ST 段抬高可反映缺血區(qū)和非缺血區(qū)電位差的差異， 以及隨后細胞膜功能的喪失， 無論是心肌梗死患者[13］還是異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌梗死大鼠[14］都可見該現(xiàn)象。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 與模型組比較， 蛇床子素組心電圖ST 段明顯下降， 給藥21 d 后心臟質(zhì)量、 心臟與體質(zhì)量的比值、 LVEDV、LVESV、 LVDd、 LVDs 明顯降低， LVFS、 LVEF、 SV 明顯增加， 表明該成分對急性心肌梗死大鼠心肌損傷和心功能有明顯改善作用。

圖3 蛇床子素對Notch1、 Jagged1 蛋白表達的影響

心肌梗死常在心肌血供突然中斷或持續(xù)時發(fā)生， 心肌細胞凋亡明顯， 同時凋亡也是動脈微血栓形成的主要原因[15］。 Bcl-2、 Bax 都屬于Bcl-2 家族， 在細胞凋亡過程中起著重要的作用， 其中前者是抗凋亡蛋白， 而后者是促凋亡蛋白， 兩者比值是凋亡發(fā)生與否的決定性因素[16］；Caspase 是進化上保守的半胱氨酸蛋白酶， 在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行中起著舉足輕重的作用[17］， 其中Caspase-3 是一種執(zhí)行分子， 在正常和病理狀態(tài)下是最豐富的Caspase， 它激活DNA 酶時最終導(dǎo)致DNA 斷裂和細胞死亡[18］， 而Caspase-9 具有促進Caspase-3 激活的作用[19-20］， 兩者參與心肌梗死過程[21-22］， 抑制其活性時可明顯減輕缺血所致心肌細胞凋亡， 提高心臟功能[23］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 蛇床子素可明顯降低Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA 表達， 提高Bcl-2 mRNA 表達， 表明該成分能減少細胞凋亡， 保護心肌細胞， 提高心功能。

HIF 作為細胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子， 由HIF-1α 和HIF-1β組成， 其中前者對缺氧敏感而穩(wěn)定， 在心肌缺血早期[24］、晚期[25］都發(fā)現(xiàn)其表達增多， 心肌梗死所誘導(dǎo)的心肌缺血缺氧部位中其表達上調(diào)對心臟具有保護作用[25-27］。 另外， 梗死部位缺血會持續(xù)很多天后才會發(fā)展到晚期階段， 在梗死后4 周， 固有HIF-1α 表達升高會減輕梗死面積， 提高心功能[28］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 蛇床子素能明顯增加HIF-1α mRNA表達， 并且具有劑量依賴性的關(guān)系。

Notch 信號通路對調(diào)節(jié)細胞增殖、 分化、 凋亡起著關(guān)鍵性作用， 心肌缺血缺氧環(huán)境會使其激活， 通過增強心肌再生、 保護缺血心肌或誘導(dǎo)血管再生來減輕心肌損傷， 并提高心功能[29-30］， 它被激活后會增加抗凋亡因子Bcl-2 表達，同時降低心力衰竭標志物Myh6、 Myh7、 Glut-1 表達及促凋亡蛋白酶Caspase-9 活性， 抑制心肌細胞凋亡[30-31］， 而該信號通路在增殖的胚胎和未成熟的心肌細胞， 或在梗死后心肌的邊緣部位都會激活[31］； Jagged1 是成熟的心肌細胞中Notch1 受體的主要配體之一[32］， 外源性的給予該配體后可激活Notch1， 進而減輕心肌損傷[30］。 還可上調(diào)Hes-1、Hey-1 mRNA 表達， 表明兩者參與Notch 信號通路對心肌的保護作用[31］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠心肌組織Notch1、 HIF-1α mRNA 表達及Notch1 蛋白表達明顯增加， Hes1、 Jagged1 mRNA 表達及Jagged1 蛋白表達也有增加趨勢， 但無顯著性差異， 表明心肌缺血缺氧在一定程度上激活了Notch 信號通路， 與文獻[7， 33］ 報道一致； 與模型組比較， 蛇床子素能明顯增加Notch1、 Hes1、Jagged1 mRNA 表達及Notch1、 Jagged1 蛋白表達， 表明該成分能顯著激活Notch1／Jagged1 信號通路， 從而發(fā)揮對缺血心肌的保護作用。

綜上所述， 蛇床子素可減輕急性心肌梗死大鼠心肌損傷， 提高心功能， 還能增加心肌組織HIF-1α， Notch1、 Jagged1 水平， 表明該成分對心臟的保護作用可能與上調(diào)HIF-1α 和激活Notch1／Jagged1 信號通路有關(guān)。 同時， HIF-1α、Notch1／Jagged1 信號途徑在將來也可能是潛在的缺血性心臟病治療靶點。