• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸棗仁中斯皮諾素對睡眠剝奪大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A 表達(dá)的影響

    2019-06-01 02:51:08廖丹瓊儲利勝張建平
    中成藥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:下丘腦貨號神經(jīng)元

    廖丹瓊, 儲利勝, 張建平, 方 燕, 李 琳, 周 青

    (1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)踐教學(xué)中心, 浙江 杭州 310053; 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 浙江 杭州 310053; 3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室, 浙江 杭州 310053)

    睡眠疾病可嚴(yán)重影響生活質(zhì)量, 降低工作效率, 隨著生活節(jié)奏加快及生活方式改變, 其發(fā)病率不斷升高, 據(jù)報道, 嚴(yán)重失眠癥的發(fā)生率約為9.38%, 全球27%左右的患者受其困擾[1]。 目前, 臨床治療失眠癥的藥物主要是化學(xué)合成類鎮(zhèn)靜催眠藥, 但長期使用會產(chǎn)生不良反應(yīng)和依賴性[2]。

    酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow 的干燥成熟種子, 性味甘、 酸、 平, 歸肝、 膽、 心經(jīng), 具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、 寧心安神、斂汗、 生津等功效, 是公認(rèn)的有效安神藥, 所含黃酮類成分斯皮諾素是發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的主要活性物質(zhì)[3], 研究表明[4], 給予大鼠低于睡眠劑量的戊巴比妥后, 斯皮諾素可顯著誘發(fā)睡眠, 并呈劑量依賴性地增強(qiáng)戊巴比妥誘導(dǎo)睡眠, 縮短睡眠潛伏期, 延長睡眠時間, 但其作用機(jī)制尚不清楚。 因此, 本實(shí)驗(yàn)采用改良多平臺睡眠剝奪法建立失眠模型, 觀察酸棗仁有效活性成分斯皮諾素對大鼠下丘腦黑色素濃集激素(MCH) 和食欲素-A (Orexin-A) 表達(dá)的影響, 初步探討該成分改善睡眠的可能作用途徑, 為失眠癥臨床治療提供高效、 安全的治療方案。

    1 材料

    1.1 動物 健康雄性SD 大鼠120 只, 體質(zhì)量200~250 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供, 動物生產(chǎn)許可證號SCXK (滬) 2017-0005。

    1.2 試藥 斯皮諾素(成都克洛瑪生物科技有限公司, 批號72063-39-9, 含有量99%); 地西泮(北京益民藥業(yè)有限公司, 國藥準(zhǔn)字H11020897, 2.5 mg/片); 一抗MCH 山羊(貨號SC-14509)、 一抗Orexin-A 山羊 (貨號SC-8070)(美國Santa cruz Biotechnology 公司); 二抗Alexa fluor 488驢抗山羊 (貨號705-545-147)、 驢血清 (貨號017-000-121) (北京吉比埃生物技術(shù)有限公司); 大鼠MCH ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司, 貨號JL21041); 大鼠Orexin-A ELISA 試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司,貨號YM-SZ1838); RNA 提取試劑(Trizol 試劑盒) (美國Invitrogen 公司, 貨號15596018); β-actin (碧云天生物技術(shù)研究所, 貨號H015); RT-PCR 試劑盒(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司, 貨號DPRT-20)。

    1.3 儀器 純水器(2000D 型, 北京長風(fēng)儀器儀表公司);倒置相差顯微鏡(TE2000-S 型, 日本Nikon 公司); 冰凍切片機(jī)(德國Leica 公司); 實(shí)時定量PCR 儀(美國Stratagene 公司); Multiskan Ascent 酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司)。

    2 方法

    2.1 造模 采用改良多平臺睡眠剝奪法[5]。 將大鼠置于設(shè)有水槽平臺的睡眠記錄箱內(nèi), 平臺周邊注滿水, 大鼠在平臺上可自行攝食飲水, 并可在平臺間活動, 當(dāng)它們進(jìn)入睡眠狀態(tài)時, 由于全身肌肉張力降低后頭部觸水而驚醒, 共進(jìn)行睡眠剝奪72 h。

    2.2 分組 60 只大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、 模型組、 地西泮組、 斯皮諾素組, 每組30 只。 對照組大鼠于模型組相同時間點(diǎn)放入正常環(huán)境的睡眠箱(未設(shè)置水槽平臺) 內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng), 給予生理鹽水; 模型組大鼠造模后給予生理鹽水; 地西泮組大鼠造模后給予地西泮(0.8 mg/kg),1 次/d; 斯皮諾素組大鼠造模后給予斯皮諾素(15 mg/kg), 給藥組均按10 mL/kg 體積于晚上19: 00 灌胃給藥, 對照組、 模型組于同時間點(diǎn)給予等體積生理鹽水,連續(xù)2 d。

    2.3 大鼠下丘腦MCH 陽性反應(yīng)表達(dá)檢測 末次給藥后4 h, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉, 立即斷頭處死, 取全腦, 腦組織經(jīng)固定、 蔗糖脫水、 OCT 包埋后切片, 厚度30 μm, 置于PBS 緩沖液中, 4 ℃下保存。 然后, 切片浸入PBS 緩沖液中漂洗, 10%驢血清、 0.3%Triton-X-100 封閉液處理30 min, 加入一抗混合液[含5%驢血清、 0.3%Triton-X-100、 山羊抗MCH (1 ∶2 000) 或Orexin-A (1 ∶2 500)的PBS 緩沖液], 4 ℃下孵育過夜, 漂洗, 用含5%驢血清、0.3%Triton-X-100、 Alexa Fluor488 驢抗山羊IgG 熒光二抗(1 ∶1 000) 的PBS 緩沖液避光孵育2 h, 漂洗, 裱片, 封片, 熒光顯微鏡下觀察。 再應(yīng)用多功能真彩病理圖像系統(tǒng),分析各組MCH、 Orexin-A 陽性表達(dá)的光密度、 面密度、 陽性細(xì)胞數(shù)。

    2.4 大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)檢測 末次給藥后4 h, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉, 立即斷頭處死, 取全腦, 冰臺上剝離下丘腦組織, Trizol 法提取總RNA, 以RNA 為模板將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA; PCR 擴(kuò)增按照相應(yīng)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行, 反應(yīng)體系為20 μL, 冰上依次加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL、 引物1 μL、 TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL, 加雙蒸水補(bǔ)至20 μL。 以β-actin為內(nèi) 參, 正 向5′-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3′, 反 向5′-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3′, 擴(kuò)增基因片段320 bp;MCH 正向5′-ATGAAGCTTTCCGTTGGTA-3′, 反 向5′-CTACACTTCCCAGCAAGGTC-3′, 擴(kuò)增基因片段175 bp; Orexin-A 正 向 5′-ATTCGGTCTGCCTGTCCC-3′, 反 向 5′-ACCGCAACCGCCTTAGCT-3′, 擴(kuò)增基因片段215 bp, 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min, 95 ℃反應(yīng)30 s, 60 ℃反應(yīng)30 s, 共40個循環(huán)。 然后, 擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠中電泳, 在凝膠圖像掃描系統(tǒng)中檢測其吸光度, 分別計算MCH、 Orexin-A吸光度與β-actin 吸光度的比值, 以此表示最終結(jié)果。

    2.5 大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A 水平 將下丘腦組織置于生理鹽水中煮5 min, 充分勻漿, 勻漿液置于EP 管中,室 溫 下 放 置 2 h, 加 入 NaOH 處 理, 4 ℃下 離 心(3 000 r/min) 10 min, 吸取上清液置于EP 管中備用, 按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測MCH、 Orexin-A 水平。 將0.1 mL 稀釋待測樣品加于已包被反應(yīng)孔中, 37 ℃下溫育1 h, 30 倍蒸餾水稀釋濃縮, 每孔加入洗滌液, 靜置30 s 后棄去, 重復(fù)3 次, 拍干, 再加入0.1 mL 酶標(biāo)抗體, 37 ℃下孵育0.5~1 h, 洗滌, 每孔依次加入顯色劑A、B 各50 μL, 輕輕振蕩混勻, 37 ℃下避光顯色15 min, 再加入終止液50 μL終止反應(yīng), 空白孔調(diào)零, 450 nm 波長處測定吸光度。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)用s) 表示, 組間比較采用t 檢驗(yàn); 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響 圖1 顯示, 在大鼠下丘腦外側(cè)區(qū), 4 組均可觀察到MCH 陽性表達(dá), 主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜, 其中對照組、 地西泮組、 斯皮諾素組較明顯, 而模型組呈散在分布, 表達(dá)較少。 表1 顯示, 與對照組比較, 模型組大鼠下丘腦MCH 陽性表達(dá)光密度、 面密度、 細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01); 與模型組比較, 斯皮諾素組三者顯著增加(P<0.01)。

    圖1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響

    表1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響(s, n=10)

    表1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響(s, n=10)

    注:與對照組比較,??P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別 光密度/% 面密度/% 陽性細(xì)胞數(shù)/個對照組 203.52±25.04 277.92±30.36 43.56±5.58模型組 65.41±11.12?? 105.40±15.99?? 22.15±5.43??地西泮組 122.10±15.33## 165.14±19.05## 33.09±5.63##斯皮諾素組 121.43±15.87## 164.03±20.13## 33.03±5.04##

    3.2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響 圖2 顯示, 在大鼠下丘腦外側(cè)區(qū), 4 組均可觀察到Orexin-A 陽性表達(dá),主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜, 其中模型組呈密集型分布, 表達(dá)增加, 而對照組、 地西泮組、 斯皮諾素組呈散在分布,表達(dá)減少。 表2 顯示, 與對照組比較, 模型組Orexin-A 陽性表達(dá)的光密度、 面密度及細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01);與模型組比較, 斯皮諾素組三者顯著減少(P<0.01)。

    圖2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響

    3.3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響 表3顯示, 與對照組比較, 模型組MCH mRNA 表達(dá)顯著降低,Orexin-A mRNA 表達(dá)顯著升高(P<0.01); 與模型組比較,斯皮諾素組前者mRNA 表達(dá)顯著升高, 后者mRNA 表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

    表2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響s, n=10)

    表2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響s, n=10)

    注:與對照組比較,??P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    對照組 404.51±43.09 517.82±53.44 68.61±7.25模型組 613.77±62.33?? 721.89±73.62?? 89.43±9.23??地西泮組 510.57±53.41## 601.55±62.12## 75.04±7.99##斯皮諾素組 508.92±52.65## 599.53±60.68## 73.51±7.85##

    表3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響0)

    表3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響0)

    注:與對照組比較,??P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    對照組 — 0.92±0.12 0.56±0.06模型組 — 0.44±0.08?? 0.91±0.10??地西泮組 0.8 0.72±0.09## 0.82±0.09##斯皮諾素組 15 0.71±0.08## 0.80±0.09##

    3.4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響 表4 顯示,與對照組比較, 模型組MCH 水平顯著降低, Orexin-A 水平顯著升高(P<0.01); 與模型組比較, 斯皮諾素組前者水平顯著升高, 后者水平顯著降低(P<0.01)。

    表4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響, n=10)

    表4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響, n=10)

    注:與對照組比較,??P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別 劑量/(mg·kg-1) MCH /(pg·mL-1)Orexin-A/(pg·mL-1)對照組 — 30.31±4.40 22.83±2.43模型組 — 18.55±3.44?? 34.66±3.90??地西泮組 0.8 24.03±4.03## 27.71±2.96##斯皮諾素組 15 23.88±3.36## 27.46±2.99##

    4 討論

    文獻(xiàn)報道, 大鼠預(yù)先(注射戊巴比妥24 h 前) 給予對氯苯丙氨酸后, 可明顯縮短戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠時間, 延長睡眠潛伏期, 而斯皮諾素能減弱上述失眠效應(yīng), 減少睡眠潛伏期, 延長睡眠時間[4]。 李佳虹等[3]利用受體配體結(jié)合技術(shù)的原理, 結(jié)合HPLC、 LC-MS/MS 技術(shù)研究酸棗仁中鎮(zhèn)靜催眠活性成分, 發(fā)現(xiàn)斯皮諾素可與地西泮競爭結(jié)合腦組織中苯二氮艸卓受體, 可能發(fā)揮了類似的鎮(zhèn)靜催眠作用。由此推測, 斯皮諾素對睡眠剝奪所致失眠發(fā)揮了改善作用,但具體作用機(jī)制尚不明確。

    MCH 神經(jīng)元主要位于下丘腦外側(cè)區(qū), 少量散在分布于未定帶區(qū)域, 其所發(fā)出的軸突廣泛分布于大腦各個區(qū)域,如弓狀核、 背內(nèi)側(cè)核、 室旁核、 腹內(nèi)側(cè)核, 以及下丘腦以外腦區(qū), 如嗅區(qū)、 海馬、 基底核和中隔、 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等, 可能通過軸突分布作用于上述的腦區(qū)或核團(tuán), 直接或間接傳遞信號, 從而發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用[6]。 Blanco-Centurion 等[7]采取光遺傳技術(shù)激活下丘腦外側(cè)區(qū)MCH 神經(jīng)元, 可顯著增加白天自由活動大鼠的非動眼、 動眼睡眠時間; Vetrivelan等[8]采取上述方法在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中獲得相似結(jié)果; 王娟等[9]研究表明, 10、 20 mg/kg 斯皮諾素均分別劑量依賴地增加慢波睡眠2.5、 3.1 倍, 減少覺醒量35.9%、 54.6%,但5 mg/kg 時不影響動物的睡眠-覺醒量。 本實(shí)驗(yàn)參照既往研究中斯皮諾素用量, 并結(jié)合課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 將其終質(zhì)量濃度設(shè)定為15 mg/kg, 然后檢測該成分對睡眠剝奪大鼠下丘腦MCH 神經(jīng)元陽性表達(dá)的影響, 發(fā)現(xiàn)斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致MCH 神經(jīng)元低表達(dá)具有改善效果。

    Orexin 神經(jīng)元主要位于下丘腦側(cè)下及穹窿周圍區(qū), 其所發(fā)出興奮性投射可到除小腦之外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他腦區(qū), 尤其以高密度纖維投射至下丘腦以及腦干單胺能神經(jīng)元, 參與睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)[10], 其Fos 表達(dá)與覺醒呈明顯正相關(guān), 而與睡眠呈顯著負(fù)相關(guān), 激活后可促進(jìn)和維持覺醒[11]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致Orexin-A 神經(jīng)元高表達(dá)具有抑制效果。

    MCH 是含有48 個氨基酸的神經(jīng)肽, 哺乳動物中它主要定位于下丘腦外側(cè)區(qū)和未定帶區(qū), 一些激活睡眠的神經(jīng)元能表達(dá)MCH 物質(zhì), 可增加慢波睡眠向快波睡眠轉(zhuǎn)變, 延長快波睡眠持續(xù)時間[12], 同時也是機(jī)體能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)睡眠的重要調(diào)節(jié)因子[13]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致MCH 表達(dá)下降有改善作用。

    Orexin-A 是由下丘腦Orexin 神經(jīng)元合成的小分子神經(jīng)神經(jīng)肽, 含33 個氨基酸, 序列在哺乳動物中相同, 它可增加覺醒及抑制睡眠, 是覺醒的重要啟動子[14], Thannickal等[15]報道, 發(fā)作性睡病患者下丘腦Orexin-A 神經(jīng)元總體缺失了33%, 其mRNA、 蛋白表達(dá)也明顯降低。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致Orexin-A 表達(dá)增加有抑制作用。

    Kitka 等[16]認(rèn)為, Orexin 神經(jīng)元能軸突投向參與睡眠調(diào)控的腦區(qū), 對覺醒起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用; MCH 神經(jīng)元可抑制其周圍及下丘腦的Orexin 神經(jīng)元, 從而促進(jìn)睡眠發(fā)生。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 推測斯皮諾素可能是通過上調(diào)下丘腦MCH 神經(jīng)元及其遞質(zhì)表達(dá), 再抑制Orexin-A 表達(dá), 從而對睡眠剝奪大鼠起到改善睡眠的效果。

    綜上所述, 酸棗仁中斯皮諾素(15 mg/kg) 對改良多平臺睡眠剝奪法所致大鼠下丘腦MCH 低表達(dá)、 Orexin-A 高表達(dá)有逆轉(zhuǎn)作用, 提示該成分改善睡眠疾病的可能作用途徑, 有望為失眠癥的中藥治療開辟新途徑。

    猜你喜歡
    下丘腦貨號神經(jīng)元
    小而強(qiáng)大的下丘腦
    《從光子到神經(jīng)元》書評
    自然雜志(2021年6期)2021-12-23 08:24:46
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    作者更正致歉說明
    躍動的神經(jīng)元——波蘭Brain Embassy聯(lián)合辦公
    科學(xué)家發(fā)現(xiàn)控制衰老開關(guān)
    中老年健康(2017年9期)2017-12-13 07:16:39
    中藥對下丘腦作用的研究進(jìn)展
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:34
    回藥阿夫忒蒙丸對失眠大鼠下丘腦5-HT和5-HIAA含量的影響
    基于二次型單神經(jīng)元PID的MPPT控制
    毫米波導(dǎo)引頭預(yù)定回路改進(jìn)單神經(jīng)元控制
    搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产亚洲欧美在线一区二区| 后天国语完整版免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 999久久久精品免费观看国产| 国产真人三级小视频在线观看| 黄色女人牲交| 国产xxxxx性猛交| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一二三四在线观看免费中文在| av国产精品久久久久影院| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产亚洲欧美98| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久综合精品五月天人人| 中文字幕色久视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 777米奇影视久久| av一本久久久久| 亚洲在线自拍视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产亚洲一区二区精品| 99在线人妻在线中文字幕 | 中文字幕制服av| 久久中文看片网| 亚洲av熟女| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产成人精品在线电影| 女人精品久久久久毛片| 欧美性长视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 大型av网站在线播放| 中文字幕色久视频| 曰老女人黄片| 亚洲第一av免费看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看免费午夜福利视频| 日日爽夜夜爽网站| 新久久久久国产一级毛片| 日韩视频一区二区在线观看| 精品久久蜜臀av无| 九色亚洲精品在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 热99re8久久精品国产| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜福利视频在线观看免费| cao死你这个sao货| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美激情在线| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成+人综合+亚洲专区| 在线观看66精品国产| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲五月婷婷丁香| 看片在线看免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 香蕉丝袜av| 女人被狂操c到高潮| 美国免费a级毛片| 亚洲成人免费av在线播放| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲综合色网址| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲黑人精品在线| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美成人午夜精品| av有码第一页| 国产成人av教育| 色播在线永久视频| 在线观看一区二区三区激情| a级毛片在线看网站| 伦理电影免费视频| 婷婷成人精品国产| 极品教师在线免费播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 在线观看66精品国产| 国产精品免费一区二区三区在线 | 757午夜福利合集在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品国产国语对白av| 午夜免费成人在线视频| av网站免费在线观看视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品国产综合久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲成人免费av在线播放| 在线天堂中文资源库| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品在线观看二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色怎么调成土黄色| 在线观看www视频免费| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩有码中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲av美国av| 极品人妻少妇av视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利欧美成人| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 极品少妇高潮喷水抽搐| 18禁美女被吸乳视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 一a级毛片在线观看| 亚洲精品自拍成人| 美女福利国产在线| 久热这里只有精品99| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人免费无遮挡视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 18在线观看网站| 欧美最黄视频在线播放免费 | 久久久精品免费免费高清| 国产精华一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 免费在线观看完整版高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 超碰成人久久| 亚洲久久久国产精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利一区二区在线看| 午夜福利免费观看在线| 国产成人影院久久av| e午夜精品久久久久久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 好男人电影高清在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美色视频一区免费| 成人影院久久| av不卡在线播放| 飞空精品影院首页| 久久久精品免费免费高清| 亚洲七黄色美女视频| 国产97色在线日韩免费| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产xxxxx性猛交| 岛国毛片在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 999久久久国产精品视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品电影一区二区在线| 亚洲视频免费观看视频| 电影成人av| 老司机福利观看| 一级毛片精品| 亚洲专区中文字幕在线| 国产成人精品无人区| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产精品久久久人人做人人爽| 一区二区三区精品91| 色播在线永久视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美一级毛片孕妇| 91字幕亚洲| 男女下面插进去视频免费观看| 久久热在线av| 欧美在线黄色| 黄色片一级片一级黄色片| 岛国在线观看网站| 成人免费观看视频高清| 搡老乐熟女国产| 国产深夜福利视频在线观看| 18在线观看网站| 亚洲成人手机| 午夜福利乱码中文字幕| 很黄的视频免费| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美黑人欧美精品刺激| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品在线观看二区| 成人手机av| 精品高清国产在线一区| 亚洲av美国av| av网站在线播放免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日本a在线网址| 精品一区二区三区av网在线观看| av在线播放免费不卡| 国产av又大| 国产精品久久久久成人av| 咕卡用的链子| 亚洲片人在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品国产高清国产av | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精品乱久久久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男女免费视频国产| 精品国产国语对白av| 国产欧美日韩一区二区三| 性少妇av在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲五月婷婷丁香| 精品福利观看| 久久人妻熟女aⅴ| 黄色a级毛片大全视频| 搡老岳熟女国产| 一级作爱视频免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产主播在线观看一区二区| 女人被狂操c到高潮| 日本黄色视频三级网站网址 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲中文av在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 色在线成人网| 女警被强在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人精品无人区| 国产1区2区3区精品| 国产主播在线观看一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲一区二区三区欧美精品| a级毛片黄视频| 大香蕉久久网| 国产成人av激情在线播放| 一级a爱片免费观看的视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美日韩精品网址| 亚洲av第一区精品v没综合| 丁香六月欧美| 99国产精品免费福利视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日本黄色日本黄色录像| 免费av中文字幕在线| 精品人妻1区二区| 一区二区三区精品91| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人免费无遮挡视频| 在线永久观看黄色视频| 国产精品免费大片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99香蕉大伊视频| 水蜜桃什么品种好| 免费高清在线观看日韩| 美女福利国产在线| 国产欧美亚洲国产| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费不卡黄色视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 18在线观看网站| 免费日韩欧美在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 在线观看66精品国产| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜成年电影在线免费观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品国产一区二区久久| 亚洲 国产 在线| 国产精品偷伦视频观看了| 曰老女人黄片| 大型av网站在线播放| 91在线观看av| 老司机影院毛片| 黄色怎么调成土黄色| av视频免费观看在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男人舔女人的私密视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 露出奶头的视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品乱久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人av教育| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲五月色婷婷综合| 大型av网站在线播放| 一本综合久久免费| 色94色欧美一区二区| 我的亚洲天堂| 99精品欧美一区二区三区四区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 天天影视国产精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久精品国产a三级三级三级| 后天国语完整版免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久精品成人免费网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜福利免费观看在线| 丝袜美足系列| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品电影一区二区三区 | 久久精品国产综合久久久| 岛国毛片在线播放| 真人做人爱边吃奶动态| 大香蕉久久网| 中文字幕高清在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 天堂√8在线中文| 9色porny在线观看| 日韩欧美三级三区| 久久人妻av系列| 在线永久观看黄色视频| 欧美大码av| 在线永久观看黄色视频| 夫妻午夜视频| 亚洲视频免费观看视频| xxx96com| 久久久久精品人妻al黑| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 日日夜夜操网爽| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲精品国产区一区二| 免费观看a级毛片全部| 热re99久久精品国产66热6| 18在线观看网站| 麻豆成人av在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 岛国在线观看网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品国产高清国产av | 超碰97精品在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产视频一区二区在线看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 黄色片一级片一级黄色片| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美色视频一区免费| 999精品在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 香蕉丝袜av| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99国产精品一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产成人精品无人区| 国产精品国产高清国产av | 悠悠久久av| tocl精华| ponron亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 在线观看免费高清a一片| 国产欧美亚洲国产| 亚洲国产欧美网| 大陆偷拍与自拍| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久久精品久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美 日韩 精品 国产| 在线观看免费午夜福利视频| 99国产极品粉嫩在线观看| e午夜精品久久久久久久| 久久久国产欧美日韩av| 高清av免费在线| 精品视频人人做人人爽| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品二区激情视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲人成77777在线视频| netflix在线观看网站| 天天添夜夜摸| 不卡av一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩av久久| 91大片在线观看| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久国产精品麻豆| 午夜日韩欧美国产| а√天堂www在线а√下载 | 久99久视频精品免费| 91字幕亚洲| 两人在一起打扑克的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩欧美在线二视频 | 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美免费精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人av教育| 国产野战对白在线观看| 欧美中文综合在线视频| 在线免费观看的www视频| 脱女人内裤的视频| 国产精品av久久久久免费| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久人妻熟女aⅴ| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 夜夜爽天天搞| 国产一区二区三区视频了| 亚洲人成电影免费在线| 精品久久久久久,| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 电影成人av| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| www.熟女人妻精品国产| 日本黄色日本黄色录像| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品98久久久久久宅男小说| 制服诱惑二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 高清av免费在线| 1024香蕉在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲欧美激情在线| 99久久国产精品久久久| 啦啦啦免费观看视频1| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清欧美精品videossex| 电影成人av| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | www.999成人在线观看| 国产精品九九99| 亚洲精品自拍成人| 国产精品国产高清国产av | 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久 成人 亚洲| 黄色女人牲交| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久精品吃奶| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品国产av在线观看| av片东京热男人的天堂| 飞空精品影院首页| 欧美黄色淫秽网站| 久久精品国产清高在天天线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产午夜精品久久久久久| av电影中文网址| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品国产区一区二| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品电影一区二区三区 | 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产xxxxx性猛交| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一级毛片女人18水好多| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美精品一区二区免费开放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费av中文字幕在线| 在线天堂中文资源库| 高清欧美精品videossex| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 校园春色视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美乱色亚洲激情| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产av一区二区精品久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产男女超爽视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 少妇粗大呻吟视频| 精品久久蜜臀av无| 天堂动漫精品| 欧美性长视频在线观看| 国产av又大| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美大码av| 天天添夜夜摸| 亚洲五月色婷婷综合| 一级作爱视频免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费在线观看日本一区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美黄色淫秽网站| 深夜精品福利| 99国产精品一区二区三区| 久久性视频一级片| 在线视频色国产色| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久国产精品影院| aaaaa片日本免费| 精品国产美女av久久久久小说| 一级毛片高清免费大全| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲伊人色综图| 成人18禁在线播放| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 视频区图区小说| 亚洲片人在线观看| 成人精品一区二区免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品人妻1区二区| 搡老乐熟女国产| 国产av精品麻豆| 在线观看免费视频日本深夜| e午夜精品久久久久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 美国免费a级毛片| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看 | 热99国产精品久久久久久7| 香蕉国产在线看| 亚洲国产精品sss在线观看 | 免费日韩欧美在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三卡| 国精品久久久久久国模美| 亚洲黑人精品在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费av中文字幕在线| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美激情在线| 少妇的丰满在线观看| 天堂√8在线中文| 成年版毛片免费区| 久久这里只有精品19| 午夜免费观看网址| 一本大道久久a久久精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 天天影视国产精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| a级毛片在线看网站| 精品人妻1区二区| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲av日韩在线播放| 精品电影一区二区在线| 伦理电影免费视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产男女内射视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 啦啦啦 在线观看视频| av免费在线观看网站| aaaaa片日本免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女国产高潮福利片在线看| 久久这里只有精品19| 99热只有精品国产| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美日韩视频精品一区| avwww免费| 9191精品国产免费久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| av欧美777| 咕卡用的链子| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 女同久久另类99精品国产91| 日本一区二区免费在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久久久久久久久免费视频 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲午夜理论影院| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品久久久久久电影网| 亚洲片人在线观看| 国产精品电影一区二区三区 | 成年版毛片免费区| 免费观看a级毛片全部| 波多野结衣av一区二区av| av天堂久久9| 免费高清在线观看日韩| 国产精品免费视频内射| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美在线黄色| 两个人看的免费小视频| 亚洲中文av在线| 欧美国产精品va在线观看不卡|