軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)肝郁脾虛型橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響

李敘穎， 張 蘭， 王 琳， 武佳琦， 范思有， 劉 佳

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧 沈陽(yáng) 110847； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110032）

橋本甲狀腺炎常以甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）、 甲狀腺球蛋白抗體（TGAb） 升高為主要特征， 最終大多數(shù)患者發(fā)展為甲狀腺功能減退癥， 是由多種致病因素相互作用而造成的。 研究表明， 細(xì)胞凋亡與橋本甲狀腺炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，凋亡大多發(fā)生于浸潤(rùn)淋巴濾泡附近， 是患者甲狀腺濾泡細(xì)胞和腺體破壞的重要機(jī)制之一[1-3］。 軟堅(jiān)消癭顆粒是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院張?zhí)m教授以《太平惠民和劑局方》 中逍遙散為基礎(chǔ)方化裁， 具有疏肝健脾、 軟堅(jiān)消癭功效的中藥復(fù)方， 本實(shí)驗(yàn)擬考察該制劑對(duì)肝郁脾虛型橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響， 以期探討相關(guān)治療機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠， 體質(zhì)量160 ～180 g， 由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （遼） 2015-0001， 適應(yīng)環(huán)境7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品 軟堅(jiān)消癭顆粒由柴胡、 白芍、 茯苓、白術(shù)， 當(dāng)歸、 海藻、 昆布等藥材組成， 經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑； 雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字Z32021007）。 無(wú)水碘化鈉、 甲狀腺球蛋白（安徽酷爾生物工程有限公司， 貨號(hào)AQ032244、 QA052105）； 弗氏不完全佐劑、 弗氏完全佐劑 （美國(guó)Sigma 公司， 貨號(hào)F5506、 F5881）。

1.3 試劑 TPO-Ab、 TGAb 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司， 貨號(hào)m1048720、m1003044）； BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物 技 術(shù) 研 究 所， 貨 號(hào) P0010S）； 兔 抗 TLR2、TLR4、 My D88、 NF-κB p65 抗體（武漢博士德生物科技有限公司）； HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG （北京中杉金橋生物科技有限公司）； ECL 發(fā)光試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司， 貨號(hào)PE0010）；TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海） 儀器有限公司， Multiskan MK3 型］； 低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus 公司， D-37520 型）； 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司， SHA-B 型）； 石蠟 切 片 機(jī) （RM2235 型）、 組 織 石 蠟 包 埋 機(jī)（EG1150 型）、 全自動(dòng)脫水機(jī)（ASP300 型） （德國(guó)徠卡公司）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠， HHB11500 型）； 熒光顯微鏡（日本Olympus公司， BX51 型）； 電泳儀（EPS300 型）、 凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-4200SF 型）、 垂直板電泳裝置（VE-180 型） （上海天能科技有限公司）； 轉(zhuǎn)印電泳槽（北京六一儀器廠， DYY-40B 型）。

2 方法

2.1 模型建立

2.1.1 藥物制備

2.1.1.1 高碘水 將0.64 g 碘化鈉晶體與1 L 蒸餾水混合， 即得（0.64 g／L）。

2.1.1.2 抗原溶液 1 mg／mL 甲狀腺球蛋白溶于PBS 緩沖液中， 即得。

2.1.1.3 初次免疫乳化劑 取等量弗氏完全佐劑、抗原溶液（體積比1 ∶1）， 通過(guò)2 個(gè)細(xì)膠管相連的注射器交替推動(dòng)制得黏稠乳劑（100 μg／0.2 mL），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.1.4 加強(qiáng)免疫乳化劑 取等量弗氏不完全佐劑、 抗原溶液（體積比1 ∶1）， 按“2.1.1.3” 項(xiàng)下方法制得油包水乳狀液（100 μg／0.2 mL）。

2.1.2 橋本甲狀腺炎模型 48 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后， 隨機(jī)取12 只作為正常組， 剩余為造模組，分籠飼養(yǎng)， 每籠6 只。 從第2 周起， 造模組大鼠飲用高碘水， 正常組大鼠給予蒸餾水； 第4 周第1、4 天， 造模組大鼠于雙后足皮下多點(diǎn)注射初次免疫乳化劑， 0.2 mL／只， 第5～8 周后背皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫乳化劑， 0.2 mL／只， 每周1 次。

2.1.3 肝郁脾虛證模型 從第5 周起， 造模大鼠采用慢性束縛應(yīng)激、 過(guò)度疲勞、 飲食失節(jié)等復(fù)合方法進(jìn)行造模， 首先用自制束縛筒限制大鼠活動(dòng)， 每天1 h； 單日令其游泳至耐力極限， 同時(shí)喂飼甘藍(lán)；雙日喂飼正常顆粒飼料， 同時(shí)灌胃給予豬油脂（1 mL／100 g 體質(zhì)量）， 連續(xù)4 周。

2.1.4 模型評(píng)價(jià) 造模后（即第9 周） 第1 天，各組大鼠球后靜脈叢穿刺采集全血2 mL， 分離血清， 檢測(cè)TGAb、 TPOAb 水平， 比較正常組、 造模組兩者水平以判斷模型是否建立成功。

2.2 分組及給藥 將造模大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷片組、 軟堅(jiān)消癭顆粒組， 每天灌胃2 次（9： 00、 15： 00 點(diǎn)各1 次）， 給藥周期為8 周， 給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4］， 并根據(jù)人與大鼠體表面積等效劑量進(jìn)行換算。 正常組、 模型組大鼠每次給予2 mL 蒸餾水； 雷公藤多苷片作為陽(yáng)性對(duì)照藥， 研磨后溶于蒸餾水中配成混懸液， 每天給藥劑量為9.45 mg／kg 生藥量， 分2 次灌胃； 軟堅(jiān)消癭顆粒置于量杯中， 煮沸蒸餾水稀釋， 溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颍?每天給藥劑量為16.17 g／kg 生藥量，分2 次灌胃。

2.3 標(biāo)本采集 治療后大鼠禁食不禁水24 h， 腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 麻醉， 沿腹白線剪開(kāi)腹腔， 腹主動(dòng)脈釆血， 分離血清， -80 ℃下凍存?zhèn)溆茫?從大鼠頭頸部氣管處迅速取出甲狀腺，分為2 份， 1 份置于凍存管中， 液氮中速凍，-80 ℃低溫冰箱中保存； 另1 份置于10%福爾馬林溶液中固定， 常溫保存， 用于石蠟切片。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 血清甲狀腺抗體 ELISA 法檢測(cè)血清TGAb、 TPOAb 水平， 具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4.2 甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù) 每只大鼠觀察3 張切片， 按照TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色， 熒光顯微鏡采集圖像， 鏡下可見(jiàn)黃綠色的陽(yáng)性細(xì)胞。 每張切片在顯微鏡下（×200） 選取5個(gè)互不重疊視野， 計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞， 取平均值， 作為甲狀腺細(xì)胞凋亡水平。

2.4.3 甲狀腺組織TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表達(dá) 采用Western blot 法。 取甲狀腺組織100 mg， 加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液1 mL， 冰上研磨勻漿， 4 ℃離心取上清， BCA 法檢測(cè)各樣品中蛋白含有量， 確定上樣量， 將配置好的分離膠和濃縮膠加到膠板中聚合， 煮沸后樣品加入電泳凝膠上， 電泳分離蛋白， 電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上， 5% 脫脂奶粉封閉， 加入一抗 （TLR2、TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 抗體均稀釋1 ∶300， βactin 1 ∶1 000）， 4 ℃下孵育過(guò)夜， TBST 洗膜3次， 加入羊抗兔二抗（稀釋1 ∶2 000）， 37 ℃下孵育1 h， TBST 洗膜3 次， ECL 發(fā)光試劑盒顯影， 圖像分析軟件分析結(jié)果， 將TLR2、 TLR4、 MyD88、NF-κB p65 條帶與對(duì)應(yīng)β-actin 條帶灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以表示， 2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析。 以P ＜0.05 為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià) 表1 顯示， 與正常組比較， 造模組TGAb、 TPOAb 水平顯著升高（P＜0.01）。

表1 2 組TGAb、 TPOAb 水平比較Tab.1 Comparison of TGAb and TPOAb levels between the two groups

表1 2 組TGAb、 TPOAb 水平比較Tab.1 Comparison of TGAb and TPOAb levels between the two groups

注：與正常組比較，??P＜0.01

正常組 12 3.75±0.38 3.65±0.31造模組 36 11.16±2.69?? 10.82±2.64??

3.2 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)TGAb、 TPOAb 水平的影響 表2 顯示， 與正常組比較， 模型組TGAb、TPOAb 水平顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較，軟堅(jiān)消癭顆粒組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)TGAb、 TPOAb 水平的影響s，n=10）Tab.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TGAb and TPOAb levels s， n=10）

表2 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)TGAb、 TPOAb 水平的影響s，n=10）Tab.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TGAb and TPOAb levels s， n=10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 TGAb／（IU·mL-1） TPOAb／（IU·mL-1）正常組 3.69±0.45 3.50±0.41模型組 10.91±2.13?? 10.23±2.64??雷公藤多苷片組 6.26±0.90## 7.40±1.16##軟堅(jiān)消癭顆粒組 4.74±0.55## 4.33±0.59##

3.3 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù)的影響表3、 圖1 顯示， 與正常組比較， 模型組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 軟堅(jiān)消癭顆粒組其凋亡數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

表3 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù)的影響n=6）Tab.3 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count ±s， n=6）

表3 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù)的影響n=6）Tab.3 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count ±s， n=6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。 由于作圖需要，每組只選6 只大鼠

正常組 13.50±3.39模型組 254.67±37.96??雷公藤多苷片組 63.33±7.50##軟堅(jiān)消癭顆粒組 71.33±16.18##

3.4 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)TLR2、 TLR4、 MyD88、 NFκB p65 蛋白表達(dá)的影響 表4、 圖2 顯示， 與正常組 比 較， 模 型 組TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.01）； 與模型組比較， 軟堅(jiān)消癭顆粒組4 種蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

4 討論

橋本甲狀腺炎屬于中醫(yī)“癭病” 范疇， 其發(fā)病主要與情志內(nèi)傷、 飲食失調(diào)等因素有密切關(guān)系，從而導(dǎo)致肝郁脾虛， 機(jī)體臟腑功能失調(diào)， 氣滯、 痰凝、 血瘀等搏結(jié)于頸前而發(fā)病。 前期研究已證實(shí)，基于疏肝健脾法組方的軟堅(jiān)消癭顆粒具有明顯降低橋本甲狀腺炎動(dòng)物模型甲狀腺自身抗體水平、 減輕甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、 抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡等多靶點(diǎn)作用[5］， 方中柴胡主要成分柴胡皂苷具有抗炎作用， 其機(jī)制是通過(guò)刺激腎上腺來(lái)促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能， 而且該成分對(duì)致炎因子釋放、 白細(xì)胞游走和滲出、 毛細(xì)血管通透性、 結(jié)締組織增生等均有影響； 白芍總苷通過(guò)影響白三烯B4 生成起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用； 當(dāng)歸可促進(jìn)非特異性免疫功能， 其水煎液能顯著抑制多種致炎劑引起的急、 慢性炎癥， 顯著增強(qiáng)動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并且其中性油總酸有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、 促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用； 白術(shù)有健脾胃、 提高機(jī)體抗病能力作用， 能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能， 提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率， 促進(jìn)細(xì)胞免疫功能， 并可增加IgG 含有量； 茯苓多糖能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能， 而羧甲基茯苓多糖還有免疫調(diào)節(jié)作用； 海藻、昆布中碘和碘化物成分可使甲狀腺機(jī)能恢復(fù)正常，腺腫縮小[6］。

表4 軟 堅(jiān) 消 癭 顆 粒 對(duì)TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響±s， n=6）Tab.4 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2，TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions ±s， n=6）

表4 軟 堅(jiān) 消 癭 顆 粒 對(duì)TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響±s， n=6）Tab.4 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2，TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions ±s， n=6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。 由于作圖需要，每組只選6 只大鼠

組別 TLR2 TLR4 MyD88 NF-κB p65正常組 0.258±0.060 0.262±0.055 0.243±0.036 0.242±0.023模型組 0.610±0.077??0.633±0.111??0.639±0.115?? 0.666±0.069??雷公藤多苷片組 0.438±0.078## 0.443±0.071## 0.432±0.090## 0.422±0.070##軟堅(jiān)消癭顆粒組 0.456±0.066## 0.466±0.051## 0.443±0.059## 0.450±0.065##

圖1 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù)的影響Fig.1 Effect of Ruanjian Xiaoying Granules on thyroid cell apoptosis count

圖2 軟堅(jiān)消癭顆粒對(duì)TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Ruanjian Xiaoying Granules on TLR2， TLR4， MyD88 and NF-κB p65 protein expressions

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡， 是由細(xì)胞內(nèi)特定基因操縱、 調(diào)控的細(xì)胞自殺行為， 在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、 發(fā)育、 死亡等過(guò)程中都存在[7］。 研究表明， 橋本甲狀腺炎中T 淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可在甲狀腺濾泡細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡， 最終導(dǎo)致腺體破壞， 并且參與了免疫應(yīng)答和炎癥的誘導(dǎo)和效應(yīng)階段[2，8］， 前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 軟堅(jiān)消癭顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)橋本甲狀腺炎大鼠細(xì)胞因子Th1／Th2 平衡， 降低Fas、 Fas-L、 Bax 等促凋亡蛋白表達(dá)、 升高抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)， 抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡， 從而起到治療自身免疫性甲狀腺炎的作用[9］； 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 該制劑治療后肝郁脾虛型橋本甲狀腺炎大鼠血清甲狀腺特異性自身抗體水平明顯降低， 甲狀腺細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少， 印證了它具有抑制橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡的作用。

Toll 樣受體（TLR） 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的先天性免疫系統(tǒng)中細(xì)胞跨膜受體及病原模式識(shí)別受體之一，通過(guò)向胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)從而引起細(xì)胞免疫應(yīng)答， 能識(shí)別病毒、 支原體、 細(xì)菌等多種病原微生物， 通過(guò)對(duì)固有免疫反應(yīng)的激活作用， 影響促炎癥因子和共刺激分子產(chǎn)生， 誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫發(fā)生[10］。 髓樣分化因子88 （MyD88） 是含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，也是其信號(hào)通路中重要因子， 能激活下游多種信號(hào)， 其中TLR2、 TLR4 能先激活MyD88 依賴性通路， 再激活下游因子， 即核因子κB （NF-κB）， 然后將信息從胞漿傳至胞核， 與相應(yīng)順式作用原件相結(jié)合， 調(diào)控一些炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[11-14］。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， 橋本甲狀腺炎甲狀腺組織中NF-κB p65 陽(yáng)性信號(hào)位于淋巴濾泡間甲狀腺上皮細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)， 少數(shù)表達(dá)于浸潤(rùn)在甲狀腺組織中的淋巴細(xì)胞， NF-κB 一方面可調(diào)控與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)的許多炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)[15］； 另一方面對(duì)細(xì)胞凋亡的作用是雙向性調(diào)節(jié)， 既能抑制凋亡的發(fā)生，也能促進(jìn)一些細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16］， 在自身免疫性甲狀腺疾病的病理發(fā)展過(guò)程中， 它通過(guò)促進(jìn)甲狀腺的炎癥介質(zhì)、 黏附分子、 趨化因子過(guò)度或持續(xù)表達(dá)， 可殺死攜帶特異抗原的細(xì)胞[17］。 由此可知，TLRs／MyD88／NF-κB 信號(hào)通路可直接轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)， 介導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡； 也可先轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥信號(hào)，再介導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 軟堅(jiān)消癭顆粒治療后肝郁脾虛型橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺組織中細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少， 同時(shí)TLR2、 TLR4、MyD88、 NF-κB p65 等蛋白表達(dá)均明顯下降。

綜上所述， 軟堅(jiān)消癭顆可粒通過(guò)抑制TLRs／MyD88／NF-κB 信號(hào)通路來(lái)減少肝郁脾虛型橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡， 并減輕甲狀腺組織濾泡細(xì)胞的破壞。