肝寶膠囊HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分同時(shí)測(cè)定

范 興， 安 昌， 陳 鳴， 楊成梓， 黃德福?

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州 350025； 2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 福建 福州 350122）

肝寶膠囊為福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院名老中醫(yī)的臨床經(jīng)驗(yàn)方， 是由青果、 虎杖、 谷芽、 麥芽、萊菔子組成的純中藥制劑， 適用于脂肪肝及急、 慢性肝炎之肝熱積滯證[1-4］， 臨床上應(yīng)用近20 年， 療效確切。 但肝寶膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不全面， 僅采用TLC 法定性鑒別大黃素， 并且尚無(wú)相應(yīng)指標(biāo)性成分的含有量測(cè)定， 無(wú)法客觀反映其內(nèi)在質(zhì)量。 為了更有效地控制肝寶膠囊質(zhì)量， 保證各批次間穩(wěn)定性和臨床療效， 本實(shí)驗(yàn)建立該制劑HPLC 指紋圖譜， 并測(cè)定其中5 種成分的含有量[5-6］， 以期為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1 儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）； KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； Milli-Q 型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥 沒(méi)食子酸（批號(hào)Y09A7Y17058） 對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司， 含有量≥98%； 芥子堿硫氰酸鹽（批號(hào)111702-200501）、 虎杖苷 （批號(hào)111575-200502）、 白藜蘆醇 （批號(hào)111535-200502）、 大黃素 （批號(hào)110756-200110）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院， 含有量均≥98%。 13 批肝寶膠囊由福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院制劑室制備（每粒裝0.34 g， 批號(hào)161108、161219、 161226、 170218、 170222、 170302、170304、 170308、 170319、 170321、 170324、170401、 170504， 編號(hào)S1～S13）。 青果、 虎杖、 谷芽、 麥芽、 萊菔子購(gòu)自福建省藥材有限公司， 經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓教授鑒定均為正品， 均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。 甲醇、乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Platisil-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸， 梯度洗脫（0～5 min， 3%乙腈； 5 ～10 min， 3%→12%乙腈； 10 ～20 min， 12% 乙腈； 20 ～70 min， 12% →35% 乙 腈； 70 ～75 min， 35% →65% 乙 腈； 75 ～90 min， 65% →70% 乙腈）； 體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm； 進(jìn)樣量7 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素對(duì)照品適量， 置于棕色量瓶中， 甲醇制成質(zhì)量濃度分別為537.93、 284.43、 2 312.57、 52.98、 105.03 μg／mL的溶液， 即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內(nèi)容物約0.34 g， 置于具塞錐形瓶中， 精密加入20 mL 甲醇， 密塞， 稱定質(zhì)量， 超聲 （250 W、 40 kHz）30 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 即得。

2.4 單味藥與陰性樣品溶液制備 按處方比例及工藝， 分別制備缺青果、 虎杖、 萊菔子的陰性樣品， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.5 HPLC 指紋圖譜

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取膠囊內(nèi)容物（編號(hào)S6），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 以11 號(hào)峰（虎杖苷） 為參照峰， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.32%， 相對(duì)峰面積RSD 均小于1.59%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取膠囊內(nèi)容物（編號(hào)S6），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 于0、 2、 4、8、 12、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以11 號(hào)峰（虎杖苷） 為參照峰， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.32%， 相對(duì)峰面積RSD均小于1.59%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取膠囊內(nèi)容物（編號(hào)S6），按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 以11 號(hào)峰（虎杖苷） 為參照峰， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.32%， 相對(duì)峰面積RSD 均小于1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 建立方法

2.6.1 相似度評(píng)價(jià) 取膠囊內(nèi)容物（編號(hào)S1 ～S13）， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖1， 共標(biāo)定出19 個(gè)共有峰， 由于11 號(hào)峰（虎杖苷） 峰面積較大， 峰形良好， 出峰時(shí)間較穩(wěn)定， 故選擇其作為參照峰（S）。 然后， 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版） 進(jìn)行分析， 以S6為參照峰進(jìn)行色譜峰自動(dòng)匹配， 采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜， 測(cè)得13 批樣品相似度分別為0.987、 0.985、 0.999、 0.992、 0.990、 0.997、0.998、 0.997、 0.987、 0.986、 0.993、 0.998、0.994， 均大于0.9， 表明各批次樣品之間的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

2.6.2 共有峰指認(rèn)歸屬 通過(guò)各峰保留時(shí)間、紫外光譜圖信息并結(jié)合對(duì)照品， 確認(rèn)出其中5 個(gè)色譜峰， 分別為4 號(hào)峰沒(méi)食子酸、 7 號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、 11 號(hào)峰虎杖苷、 16 號(hào)峰白藜蘆醇、19 號(hào)峰大黃素。 然后， 將各單味藥材、 陰性對(duì)照?qǐng)D譜、 肝寶膠囊指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)， 確認(rèn)了19個(gè)共有峰主要來(lái)自青果、 虎杖、 萊菔子， 其中1 ～6、 8 ～10 號(hào)峰來(lái)自青果， 11、 14 ～19 號(hào)峰來(lái)自虎杖， 7、 13 號(hào)峰來(lái)自萊菔子， 12 號(hào)峰來(lái)自青果和萊菔子， 見(jiàn)圖2。

圖1 13 批肝寶膠囊HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of thirteen batches of Ganbao Capsules

圖2 各樣品共有峰HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of common peaks of various samples

2.7 含有量測(cè)定

2.7.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、 供試品、陰性樣品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖3。 由圖可知， 陰性樣品在對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰， 表明對(duì)測(cè)定無(wú)干擾， 方法專屬性良好。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.3、0.9、 1.5、 2.1、 2.7、 3.3 mL， 置于25 mL 棕色量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程分別為沒(méi)食子酸Y=1 201.9X-24 152 （r=0.999 4）、 芥子堿硫氰酸鹽Y=1 329.9X-18 648 （r=0.999 6）、 虎杖苷Y=4 943.5X-385 062 （r=0.999 5）、 白藜蘆醇Y=6 437.2X ＋7 355.9 （r = 0.999 6）、 大黃素Y =2 116.4X-10 507 （r=0.999 6）， 分別在45.19 ～497.05、 23.89 ～ 262.81、 194.26 ～ 2 136.81、4.45～48.95、 8.82 ～97.05 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素峰面積RSD 分別為0.71%、 0.82%、 0.78%、0.98%、 0.93%， 表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（編號(hào)S6）， 于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素峰面積RSD分別為1.06%、 1.21%、 0.96%、 1.32%、 1.17%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取膠囊內(nèi)容物（編號(hào)S6） 6 份， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素含有 量 RSD 分 別 為 1.17%、 1.58%、 1.22%、1.76%、 1.63%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的膠囊（編號(hào)S6） 9 份， 每份約0.17 g， 平均分成3組， 以80%、 100%、 120%水平分別精密加入對(duì)照品溶液[沒(méi)食子酸（537.93 μg／mL） 0.60、 0.75、0.90 mL， 芥 子 堿 硫 氰 酸 鹽 （284.43 μg／mL）0.69、 0.86、 1.03 mL， 虎杖苷（2 312.57 μg／mL）0.28、 0.35、 0.42 mL， 白藜蘆醇（52.98 μg／mL）0.50、 0.62、 0.74 mL， 大黃素（105.03 μg／mL）0.72、 0.90、 1.08 mL］， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素平均加樣回收率分別為99.85%、99.46%、 99.97%、 98.95%、 99.67%， RSD 分別為1.56%、 1.98%、 1.42%、 2.13%、 2.01%。

2.7.7 樣品含有量測(cè)定 取13 批膠囊， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 肝寶膠囊中青果、 虎杖同為君藥， 其中前者清熱解毒， 利咽生津， 主要活性成分沒(méi)食子酸具有明顯保肝、 抗肝纖維化作用[7-10］，而后者利濕退黃， 清熱解毒， 散瘀止痛， 止咳化痰， 主要活性成分虎杖苷、 白藜蘆醇、 大黃素可對(duì)脂肪肝起到較好的改善作用[11-15］； 萊菔子為佐使藥， 消食除脹， 降氣化痰， 能調(diào)節(jié)脾胃之氣機(jī)，芥子堿硫氰酸鹽為其有效成分之一。 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇沒(méi)食子酸、 芥子堿硫氰酸鹽、 虎杖苷、 白藜蘆醇和大黃素作為肝寶膠囊含有量測(cè)定的指標(biāo)成分。

表1 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.1 Results of content determination of various constituents （n=3）

3.2 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑（70%乙醇、 70%甲醇、 甲醇、 純水）， 發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果較優(yōu)， 此時(shí)各成分響應(yīng)較完全， 色譜基線穩(wěn)定。 然后， 比較了不同提取方法（超聲、 回流）及提取時(shí)間（20、 30、 40 min）， 發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取30 min 時(shí)提取率較高， 可提取完全。

3.3 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了不同流動(dòng)相（甲醇-0.1%磷酸、 乙腈-0.1%磷酸、 乙腈-3%冰醋酸、 乙腈-水）， 發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)分離效果最好。 為了使各成分均有較好響應(yīng)， 本實(shí)驗(yàn)比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（254、 270、 305、 326 nm），發(fā)現(xiàn)在305 nm 處色譜峰較多， 峰形較好， 同時(shí)各成分均有吸收， 分離度理想。