HPLC-MS法測定大鼠血漿中廣藿香酮衍生物PPCl濃度及其藥動學(xué)研究

張嵐 彭成 程芳 陳婕妤 潘媛 韓波 張若琪

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培養(yǎng)基地，成都 611137)

廣藿香為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin[(Blanco) Benth]的地上干燥部分[1]，廣藿香酮為其主要有效成分之一。本實驗室前期就廣藿香酮的藥理活性以及藥動學(xué)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗真菌活性和良好的生物利用度[2-4]。但由于廣藿香酮側(cè)鏈處于一個較大的疏水空腔，致使其與抗菌關(guān)鍵作用靶點為四硝季戊四醇還原酶結(jié)合不緊密，影響其抗菌效應(yīng)。為改善其抗菌活性，提高藥物與靶點的結(jié)合能力，本實驗室在廣藿香酮的側(cè)鏈引入大位阻的疏水官能團，合成一系列廣藿香酮衍生物，其中廣藿香酮衍生物PPCl抗菌作用顯著，具有較大的開發(fā)前景[5]。

廣藿香酮衍生物PPCl為3(2E,4E)-5-(4-氯代苯基)戊-2,4-烯酰基)-4-羥基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮 (3(2E,4E)-5-(4- chlorophenyl) penta-2, 4-dienoyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one)，是本實驗室以脫氫乙酸和有機醛為原料，利用Alodl加成反應(yīng)，二苯基脯氨醇三甲基硅醚為催化劑合成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。前期研究表明PPCl具有良好的抗菌活性，對革蘭陽性菌的抑制活性較強，尤其對金黃色葡萄球菌效果明顯，MIC值為4μg/mL。其抗菌機制可能是通過破壞細菌DNA結(jié)構(gòu)、抑制胞內(nèi)酶活性、抑制細菌核酸、蛋白質(zhì)和ATP等[5-7]。由此可見，PPCl抗菌效果佳，具有良好的開發(fā)前景，本實驗通過研究該藥物的藥動學(xué)參數(shù)，為PPCl進一步研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物和試劑

廣藿香酮衍生物PPCl(純度≥95%，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院韓波教授提供)；大黃素對照品(純度≥98%，批號為150422，成都克洛瑪生物科技有限公司)；乙腈(色譜級，美國Fisher公司)、甲醇(色譜級，美國Fisher公司)、醋酸銨(色譜級，美國Fisher公司)、水(色譜級，美國Fisher公司)、乙酸乙酯(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 實驗儀器

圖1 廣藿香酮衍生物(PPCl)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural of pogostone derivative (PPCl)

高效液相色譜儀(Agilent1260型號，包括四元梯度泵，在線脫氣機，自動進樣器)，三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 6410C，包括ESI電離源，Mass Hunter工作站軟件系統(tǒng))；電子分析天平(型號BP-211D，德國Sartorius公司)；渦旋振蕩器(型號：2E-179277，美國Vortex-Genie公司)；Allegra X-30系列離心機(型號：ALZ138033，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司)；氮氣吹掃儀(型號：MD200，杭州奧盛儀器有限公司)；超聲清洗波器(型號：KQ-5200E，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

SD大鼠8只(SPF級，雌雄各半)，體重200～220g，成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SYXK(川)2015-030。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 ECC18(3mm×100mm, 2.7μm)；保護柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3mm×5mm, 2.7μm)；流動相A為5mmol/L醋酸銨水，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～1min：55%乙腈，1～3min：55%～80%，乙腈，3～8min：80%乙腈；流速：0.3mL/min；柱溫：25℃；進樣量：5μL。

離子源：ESI，負離子模式，以氮氣做干燥氣，流速：12L/min，脫溶劑溫度：300℃，霧化室壓力：45.0psi，毛細管電壓：4000V，碰撞能量：11V，碎裂電壓：90V，掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。PPCl和大黃素的檢測離子分別為：m/z315→231和m/z268.9→239.8，268.9→224.9。

2.2 溶液的配制

精密稱取適量廣藿香酮PPCl對照品和大黃素對照品，用甲醇分別稀釋溶解定容成濃度為308μg/mL的PPCl貯備液和190μg/mL的大黃素貯備液；用甲醇分別稀釋PPCl貯備液和大黃素貯備液，依次配制成：30800、23100、15400、9240、4620、1386、415.8、83.16和33.26ng/mL的PPCl標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和濃度為3800ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品處理方法

分別取50μL內(nèi)標(biāo)溶液和50μL PPCl標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入到50μL空白血漿中，混勻后加入1.3mL乙酸乙酯，渦旋混勻3min后，離心(12000r/min，4℃，10min)，取上清液，常溫下氮氣吹干，用流動相復(fù)溶后，渦旋1min，超聲10s后離心(12000r/min，4℃，10min)，取上清液進行分析，進樣量：5μL。

2.4 方法和結(jié)果

2.4.1 專屬性考察

按“2.3”項方法操作，分別制備空白血漿樣品、加入PPCl工作溶液和大黃素溶液的血漿樣品以及大鼠灌胃給藥后的血漿樣品，得到色譜圖A～C。結(jié)果表明PPCl和大黃素的出峰時間分別為6.3min和4.8min，二者分離性良好，血漿中的雜質(zhì)不影響樣品的測定，專屬性良好，結(jié)果如圖2所示。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

按“2.3”項方法操作，于空白血漿中分別精密加入PPCl工作液和內(nèi)標(biāo)溶液，配成濃度為30800、23100、15400、9240、4620、1386、415.8、83.16和33.26ng/mL的血漿樣品，內(nèi)標(biāo)的血漿濃度為3800ng/mL。以“2.1”項色譜質(zhì)譜方法測定PPCl的濃度，以PPCl的濃度為橫坐標(biāo)，PPCl與大黃素峰面積的比值為縱坐標(biāo)做回歸運算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0011x+0.0184，r=0.997(權(quán)重=1/W1.5)。PPCl在33.26～30800ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為33.26ng/mL。

圖2 PPCl和內(nèi)標(biāo)在大鼠血漿中的MRM色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of PPCl and IS in rat plasma

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度

按“2.3”項方法操作，在空白血漿中加入濃度為33.26、83.16、4620和23100ng/mL的工作溶液，制備質(zhì)控樣本，每個濃度做6個樣本。連續(xù)測定3個分析批，計算該方法的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明此方法下PPCl的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均符合《藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則要求》。

表1 PPCl大鼠血漿樣品的精密度和準(zhǔn)確度Tab.1 Precision and accuracy for PPCl in rat plasma

2.4.4 提取回收率

按“2.3”項方法操作，分別制備83.16、4620和23100ng/mL 3個濃度的血漿樣品，每個濃度5個樣本，按照“2.1”項色譜質(zhì)譜條件下測得PPCl和大黃素的峰面積之比，記為A1；另取空白血漿按照“2.3項處理后，取上清液，加入質(zhì)量濃度分別為83.16、4620和23100ng/mL的PPCl工作溶液和濃度為3800ng/mL大黃素溶液，每個樣品5個濃度，常溫下氮氣吹干，流動相復(fù)溶，渦旋1min，超聲10s后離心(12000r/min,4℃, 10min)，取上清液進行分析，得到藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，記為A2；回收率=A1/A2×100%(表2)。

2.4.5 基質(zhì)效應(yīng)

于空白Ep管中，分別加入濃度為83.16、4620和23100ng/mL濃度的PPCl的工作溶液和30800ng/mL的大黃素內(nèi)標(biāo)溶液，每個濃度5個樣本，常溫下氮氣吹干，流動相復(fù)溶，渦旋1min，超聲10s后離心(12000r/min, 4℃, 10min)，取上清液按照“2.1”項色譜質(zhì)譜條件測定PPCl與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，記為A3；基質(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%，結(jié)果表明基質(zhì)對樣品的測定無明顯影響(表2)。

2.4.6 穩(wěn)定性考察

按“2.3”項方法操作，分別考察83.16、4620和23100ng/mL 3個濃度的血漿樣本于室溫下放置12h、經(jīng)處理后的血漿樣本在自動進樣器中放置24h(室溫)、經(jīng)3次凍存復(fù)溶的穩(wěn)定性以及在-20℃環(huán)境下冰凍放置30d后的穩(wěn)定性，每個濃度5個樣本，結(jié)果如表3。

表2 PPCl大鼠血漿樣品回收率和基質(zhì)效應(yīng)(n=5)Tab.2 Extraction recovery and matrix effect of PPCl in rat plasma (n=5)

表3 PPCl大鼠血漿樣品的穩(wěn)定性(n=5)Tab.3 The stability of PPCl in rat plasma (n=5)

2.5 方法應(yīng)用和結(jié)果

2.5.1 實驗動物和樣品處理

選取8只SD大鼠(雌雄各半)單劑量灌胃給予10mg/kg的PPCl，于給藥前及給藥后0.5、1、3、5、8、10、12 、17、24、36、48和72h眼眶取血0.3mL，置于肝素化離心管中，離心(3500 r/min, 4℃,15min)，取上清液血漿，貯藏于-20℃待用。

2.5.2 藥動學(xué)參數(shù)的計算

按“2.3”項方法處理后，以“2.1”項色譜質(zhì)譜條件檢測PPCl的濃度，應(yīng)用軟件：Phoenix WinNonlin 6.3，以非房室模型處理所得數(shù)據(jù)，得出相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果如表4，平均藥-時曲線如圖3。

3 實驗討論

本研究采用HPLC-MS法對PPCl在SD大鼠血漿中的濃度進行了測定，以與PPCl結(jié)構(gòu)相似的大黃素作為內(nèi)標(biāo)，利用乙酸乙酯萃取的方法處理血漿樣品，方法專屬性高，無內(nèi)源性雜質(zhì)影響。其次，在流動相中加入醋酸銨鹽，增強藥物的離子響應(yīng)，改善待測物的峰型，提高靈敏度，最低可測濃度達到3ng/mL。本實驗采用梯度洗脫程序，提高水相比例，讓極性大的內(nèi)源性物質(zhì)先出峰，避免雜質(zhì)影響藥物的響應(yīng)，降低基質(zhì)效應(yīng)[8]，提高方法的穩(wěn)定性。

本實驗通過對PPCl在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究，首次獲得了相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)。該藥物的半衰期為(14.57±1.93)h，半衰期較長，在體內(nèi)的滯留時間長，消除緩慢，可能與藥物的吸收或者血漿蛋白結(jié)合率有關(guān)。本實驗建立的測定大鼠血漿中PPCl的HPLCMS法，能夠滿足PPCl藥動學(xué)的研究，得到的藥動學(xué)數(shù)據(jù)為PPCl進一步的研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

表4 大鼠灌胃給予PPCl的主要藥動學(xué)參數(shù)(x±s , n=8)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of PPCl in rats plasma after intragastric administration of 10mg/kg PPCl (x±s , n=8)

圖3 PPCl按10mg/kg灌胃給藥后大鼠平均藥-時曲線(n=8)Fig.3 Mean plasma concentration-time profiles of PPCl in rats plasma after intragastric administration of 10mg/kg PPCl(n=8)