胚挽救技術(shù)在我國(guó)無(wú)核葡萄育種中的應(yīng)用及展望

趙艷卓，陳展，牛早柱，魏建國(guó)，牛帥科，楊麗麗

（河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹(shù)研究所，河北 石家莊 050061）

葡萄（Vitis vinifera）是世界四大水果之一，栽培遍及五大洲，鮮食葡萄因粒大味美而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。無(wú)核葡萄外形美觀，品質(zhì)優(yōu)良，食用方便，在鮮食市場(chǎng)和制干領(lǐng)域均占據(jù)重要地位。目前，無(wú)核葡萄品種是我國(guó)各葡萄產(chǎn)區(qū)的主推品種[1]，其中，大部分為國(guó)外育成品種，國(guó)內(nèi)育成品種較少。市售鮮食無(wú)核葡萄中大多是將有核品種經(jīng)過(guò)無(wú)核化處理后得到的，如玫瑰香、巨峰、藤稔、紅地球、醉金香、陽(yáng)光玫瑰等，天然無(wú)核品種只占一小部分。隨著國(guó)際果品安全進(jìn)程的不斷推進(jìn)，利用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)葡萄無(wú)核化勢(shì)必要被應(yīng)用綠色安全的無(wú)核品種所取代。因此，加大無(wú)核葡萄育種力度，選育大粒、優(yōu)質(zhì)且具香味的鮮食無(wú)核葡萄品種成為當(dāng)今葡萄育種的主要目標(biāo)[2，3]。

無(wú)核葡萄育種途徑有芽變選種、雜交育種、多倍體育種、胚挽救育種、分子標(biāo)記輔助育種等，其中雜交育種是無(wú)核葡萄育種的主要手段。傳統(tǒng)的雜交方式只能以有核葡萄為母本，依靠傳遞力強(qiáng)的無(wú)核父本來(lái)傳遞無(wú)核性狀，利用這種方式選育無(wú)核葡萄品種效率很低，雜種后代中無(wú)核的幾率一般不超過(guò)15%[4]，且選育過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)。但這一狀況在1982年因Ramming等創(chuàng)立無(wú)核葡萄胚挽救（embryo rescue）技術(shù)而改變。胚挽救技術(shù)是運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)假單性結(jié)實(shí)或其他發(fā)育有障礙的受精胚或胚珠，在其合子胚敗育之前進(jìn)行離體培養(yǎng)，阻止幼胚敗育，利用胚乳及培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)使其發(fā)育成充實(shí)的胚，最終形成完整的植株[5]。該技術(shù)使無(wú)核葡萄×無(wú)核葡萄的雜交方式成為現(xiàn)實(shí)，是目前無(wú)核葡萄育種研究中發(fā)展最快的新興實(shí)用技術(shù)，推動(dòng)了無(wú)核葡萄的育種進(jìn)程。我國(guó)自20 世紀(jì)90年代開(kāi)始無(wú)核葡萄胚挽救技術(shù)研究，現(xiàn)已在無(wú)核葡萄種質(zhì)創(chuàng)新[4，6～15]、三倍體無(wú)核品種選育[8，10，11，16～20]、抗性品種選育[21～26]等方面廣泛應(yīng)用，同時(shí)對(duì)影響胚挽救的不同因素[3，9，21，24，27～34]進(jìn)行了研究。

1 胚挽救技術(shù)在無(wú)核葡萄育種中的應(yīng)用

1.1 雜交育種

雜交育種是葡萄育種中使用最廣泛的技術(shù)。我國(guó)培育的葡萄品種中，約有70%是通過(guò)雜交獲得的[5，35]。與傳統(tǒng)育種相比，胚挽救技術(shù)因獲得的子代無(wú)核率高，且育種周期短，而被廣泛應(yīng)用于葡萄無(wú)核種質(zhì)的創(chuàng)制。通過(guò)葡萄種內(nèi)雜交，或者與葡萄屬其他種間雜交，如與圓葉葡萄（V.rotundifolia）、山葡萄（V.amureusis Rupr.）、刺葡萄（V.davidii Foex.）、蘡薁葡萄（V.thunbergii Sieb.）、歐山雜種葡萄等雜交，我國(guó)葡萄科技工作者獲得了許多具有不同特性的無(wú)核葡萄新種質(zhì)[7～9，24，26，36]。如，為培育無(wú)核、香味葡萄新品種，多位學(xué)者以無(wú)核葡萄品種做母本，二倍體或四倍體玫瑰香型葡萄或優(yōu)系做父本，配置不同雜交組合，獲得了一批胚挽救株系[7，9，29，37，38]。

1.2 三倍體育種

目前獲得三倍體葡萄的有效途徑是二倍體與四倍體進(jìn)行有性雜交，但由于染色體的不均衡性，導(dǎo)致胚在發(fā)育早期即發(fā)生敗育，或獲得的雜交種子生活力低，造成育種效率低下。利用胚挽救技術(shù)可阻止三倍體雜交幼胚的早期敗育，獲得三倍體植株，從而提高育種效率。李世誠(chéng)等[39]較早（1998年）應(yīng)用胚挽救技術(shù)得到了三倍體葡萄植株，隨后，眾多學(xué)者也通過(guò)胚挽救技術(shù)得到了三倍體葡萄，并對(duì)三倍體育種中胚挽救技術(shù)的影響因素以及三倍體植株的鑒定進(jìn)行了研究[17，20，39～43]。近期，田淑芬等[29，37，38]以二倍體無(wú)核品種希姆勞特、紅寶石無(wú)核、奧迪亞無(wú)核為母本，與四倍體品種巨玫瑰雜交，并對(duì)影響胚發(fā)育及成苗的因素進(jìn)行了研究，經(jīng)倍性檢測(cè)獲得‘希姆勞特×巨玫瑰’的三倍體幼苗1 株。

在三倍體育種方面，多數(shù)研究是在歐亞種葡萄與歐美雜種葡萄間進(jìn)行，僅有少數(shù)研究是在歐亞種與歐山雜種[19]、刺葡萄[44]間進(jìn)行。唐冬梅[8]對(duì)不同倍性雜交組合后代進(jìn)行分析后認(rèn)為，2x×4x 雜交方式較4x×2x 雜交方式能得到更多的雜交后代，但4x×2x 雜交方式較2x×4x 雜交方式獲得的雜交后代中三倍體的比例高。

1.3 遠(yuǎn)緣雜交育種及抗性育種

目前生產(chǎn)上廣泛栽培的無(wú)核葡萄品種多數(shù)屬于歐亞種，其果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，但抗病性和抗逆性較差。葡萄屬其他種則具有不同的品質(zhì)特性以及優(yōu)秀的抗病、抗逆性，如圓葉葡萄對(duì)根瘤蚜完全免疫，我國(guó)野生葡萄中的山葡萄具有極佳的抗寒性，但由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，造成傳統(tǒng)的育種方法效率低。而利用胚挽救技術(shù)可以提高培育抗病、抗逆無(wú)核葡萄新品種的效率。

在遠(yuǎn)緣雜交方面，1988年Goldy 等首次利用胚挽救技術(shù)將歐亞種無(wú)核葡萄與圓葉葡萄遠(yuǎn)緣雜交，探究了獲得葡萄新種質(zhì)的可能性。在國(guó)內(nèi)，潘學(xué)軍等[43]首次報(bào)道了利用圓葉葡萄與歐亞種葡萄雜交，成功獲得亞屬間雜種苗19 株。隨后，其他學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了蘡薁葡萄泰山-2[23，26]，刺葡萄塘尾[23，25]、紫秋[44]、雪峰[19]，秋葡萄江西-2[23]，燕山葡萄[45]，秦嶺葡萄平利-5[45]等與歐亞種或歐美雜種葡萄進(jìn)行雜交的研究。

在抗逆性方面，除少數(shù)學(xué)者采用蘡薁葡萄泰山-2、刺葡萄塘尾、秋葡萄江西-2 等，多數(shù)學(xué)者采用抗寒性極強(qiáng)的山葡萄如黑龍江實(shí)生、左山74-1-326、雙優(yōu)等或抗寒性較強(qiáng)的歐山雜種北醇、北冰紅等與歐亞種葡萄雜交，以提高歐亞種葡萄的抗寒性[8，23，45～47]。應(yīng)用分子輔助標(biāo)記對(duì)胚挽救苗進(jìn)行早期篩選，能夠大大提高育種效率。劉巧[26]和趙雅楠等[21]利用張劍俠等[48]獲得的2 個(gè)山葡萄抗寒基因連鎖RAPD 標(biāo)記S241-717和S238-854 對(duì)胚挽救苗進(jìn)行早期檢測(cè)，分別獲得攜帶抗寒分子標(biāo)記的雜種株系55 個(gè)和15 個(gè)。

在抗病性方面，少數(shù)學(xué)者利用分子標(biāo)記，如抗炭疽病基因RAPD 標(biāo)記OPC15-1300，抗黑痘病基因RAPD 標(biāo)記OPS03-1354，抗霜霉病基因RAPD 標(biāo)記S294 和S382，抗白粉病基因標(biāo)記ScORN3-R 等，對(duì)具有無(wú)核基因的胚挽救苗進(jìn)行了抗病性篩選，獲得具有單抗或雙抗的無(wú)核葡萄新種質(zhì)。郭海江等[49]得到擁有抗黑痘病基因的胚挽救苗9 株，擁有抗炭疽病基因的胚挽救苗1 株，同時(shí)擁有抗炭疽病和抗黑痘病基因的胚挽救苗4 株。張劍俠等[22]得到擁有抗黑痘病基因的雜種4 株。王剛[24]對(duì)篩選出的擁有抗霜霉病基因的株系接種霜霉病菌后再次篩選，得到抗病品系10 個(gè)。趙炅[25]對(duì)65 個(gè)胚挽救雜交后代株系進(jìn)行抗白粉病基因檢測(cè)，但未擴(kuò)增出抗白粉病標(biāo)記的特異性條帶。

2 胚挽救技術(shù)在無(wú)核葡萄育種中取得的成果

我國(guó)自20 世紀(jì)90年代開(kāi)始無(wú)核葡萄胚挽救研究以來(lái)，在胚挽救技術(shù)關(guān)鍵因素的優(yōu)化、三倍體育種、抗性育種等方面進(jìn)行了大量研究。目前，我國(guó)進(jìn)行無(wú)核葡萄胚挽救育種相關(guān)研究的主要單位是西北農(nóng)林科技大學(xué)王躍進(jìn)團(tuán)隊(duì)。該團(tuán)隊(duì)自1998年起系統(tǒng)開(kāi)展了無(wú)核葡萄胚挽救育種研究，包括對(duì)無(wú)核葡萄×無(wú)核葡萄、無(wú)核葡萄×有核葡萄的雜交組合以及無(wú)核品種自交的胚挽救操作影響條件的優(yōu)化，建立了無(wú)核葡萄胚挽救技術(shù)體系；以中國(guó)野生葡萄做父本與歐亞種無(wú)核葡萄雜交，進(jìn)行抗病、抗寒無(wú)核葡萄胚挽救育種，獲得了一批中國(guó)野生葡萄與歐洲葡萄雜交F1代優(yōu)系，選育出大粒無(wú)核抗病優(yōu)系00-3-1、大粒無(wú)核優(yōu)系00-2-7 等，以及秦紅無(wú)核、秦翠無(wú)核、秦紅一號(hào)等[4]新品種。

天津師范大學(xué)/天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院田淑芬團(tuán)隊(duì)、北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所徐海英團(tuán)隊(duì)、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)、上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、新疆葡萄瓜果開(kāi)發(fā)研究中心、河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所等也利用胚挽救技術(shù)，在香味、抗病、抗逆無(wú)核葡萄育種方面進(jìn)行了大量研究。其中，河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所趙勝建團(tuán)隊(duì)較早應(yīng)用胚挽救技術(shù)育成了三倍體葡萄品種無(wú)核早紅[42]；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔣愛(ài)麗團(tuán)隊(duì)先后育成了無(wú)核葡萄新品種滬培1 號(hào)[50]、滬培2 號(hào)[17]、申愛(ài)[51]和滬培3 號(hào)[18]。

3 無(wú)核葡萄胚挽救技術(shù)的影響因素

3.1 親本基因型

母本材料胚的可挽救性是無(wú)核葡萄雜交胚能否成功挽救的關(guān)鍵因素[4，9]。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，紅寶石無(wú)核[7，9，26，36]、火焰無(wú)核[7，23，31，36]、昆香無(wú)核[7，25，31]、奧迪亞無(wú)核[52]、京早晶、奧蘭多無(wú)核、紅臉無(wú)核、黎明無(wú)核、京早白、愛(ài)神玫瑰[23]等可挽救性比較好，適宜做母本；無(wú)核白、希姆勞特、波爾萊特、優(yōu)無(wú)核、克瑞森無(wú)核等胚過(guò)早發(fā)生敗育或可挽救性差的品種不適宜做母本[31，53，54]。唐冬梅[8]對(duì)幾個(gè)無(wú)核品種胚挽救的難易程度進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，胚挽救由易到難的品種順序?yàn)閵W迪亞無(wú)核、奇妙無(wú)核、火焰無(wú)核、優(yōu)無(wú)核、無(wú)核紫、皇家秋天、底來(lái)特、黎明無(wú)核、無(wú)核白、森田尼無(wú)核。田淑芬等[52]對(duì)不同品種自交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，奧迪亞無(wú)核自交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率最高，其次是紅寶石無(wú)核、希姆勞特，森田尼無(wú)核最低。

雜交父本對(duì)胚挽救的成功率也有影響。通常用無(wú)核性狀傳遞能力強(qiáng)的品種如無(wú)核白、無(wú)核黑，或起源于二者的無(wú)核品種或品系做父本，后代可分離出較高比例的無(wú)核個(gè)體[4，53]。郭雨瑞[31]進(jìn)行了提高無(wú)核葡萄胚挽救育種效率的研究，結(jié)果顯示，玫瑰香和北冰紅分別與火焰無(wú)核雜交時(shí)，利用玫瑰香的挽救效果優(yōu)于北冰紅；當(dāng)昆香無(wú)核做母本時(shí)，北冰紅做父本的挽救效果優(yōu)于泰山-2 做父本；當(dāng)奇妙無(wú)核做母本時(shí)，陽(yáng)光玫瑰和雙優(yōu)做父本的挽救效果優(yōu)于北冰紅做父本。史文靜等[7]研究指出，香味品種中玫瑰香適合作為父本進(jìn)行香味無(wú)核種質(zhì)的選育。牛茹萱等[47]報(bào)道，歐山雜種較山葡萄更適宜于做雜交父本。

3.2 接種時(shí)期

接種時(shí)期是影響胚挽救效果的另一關(guān)鍵因素。研究表明，在胚大量敗育前、胚發(fā)育至心形胚或更高程度時(shí)進(jìn)行胚挽救對(duì)于成功挽救具有決定性影響。但迄今為止，還沒(méi)有一個(gè)普遍適用的選擇最佳接種時(shí)期的方法或指標(biāo)。目前，大多數(shù)學(xué)者采用授粉后天數(shù)或盛花后天數(shù)作為接種時(shí)期的具體指標(biāo)來(lái)間接反映胚珠內(nèi)胚的發(fā)育程度。研究表明，不同品種和雜交組合的最佳接種時(shí)間不盡相同[7，9，10，31，54～57]（表1）。

表1 部分葡萄品種和雜交組合的最佳接種時(shí)間Table 1 Optimum inoculation time of some grape varieties and hybrid combinations （d）

相同的品種及雜交組合，因植株?duì)顩r、地理環(huán)境或者研究者取樣間隔的不同，最佳采樣時(shí)間會(huì)有所差異。田淑芬等[52]研究指出希姆勞特自交胚的最佳取樣期為授粉后54 d，而此前報(bào)道的希姆勞特自交胚最佳采樣時(shí)間為授粉后42 d[54]。紅寶石無(wú)核在南方的最佳采樣期為花后33～41 d[32]。父本基因型對(duì)雜交組合的取樣時(shí)間也有一定的影響[24]。實(shí)踐中，需針對(duì)具體的親本組合進(jìn)行采樣時(shí)間的優(yōu)化。

3.3 培養(yǎng)基

3.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 無(wú)核葡萄的胚挽救過(guò)程分為胚珠內(nèi)幼胚發(fā)育、胚萌發(fā)、胚成苗3 個(gè)階段。在胚珠培養(yǎng)階段應(yīng)用的培養(yǎng)基有ER、MS、B5、White、Nitsch、NN、改良MM3、MM4 等，其中，Nitsch 培養(yǎng)基和ER 培 養(yǎng)基應(yīng) 用 得 較 多[29，36，47，57，58]。但 不 同 品種或雜交組合的最適培養(yǎng)基不同，如，波爾萊特做母本時(shí)適合ER 培養(yǎng)基，紅無(wú)籽露做母本時(shí)適合MM4 培養(yǎng)基[47]。趙雅楠等[21]對(duì)接種于MM3 和ER基本培養(yǎng)基上胚珠的胚發(fā)育率和成苗率進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，MM3培養(yǎng)基處理的指標(biāo)值均高于ER 培養(yǎng)基處理。在胚萌發(fā)和成苗階段應(yīng)用的培養(yǎng)基有Nitsch、ER、BD、1/2 MS、WPM、MM4，其中，使用較多的是1/2 MS 和WPM[7，36，37，47，59，60]。

3.3.2 外源添加物 在外植體培養(yǎng)中，適宜的外源激素種類(lèi)及配比起著重要作用。不同葡萄品種對(duì)激素的敏感程度存在顯著差異，并且隨胚的發(fā)育程度而變化。胚發(fā)育程度越高，對(duì)激素的要求越不嚴(yán)格。多數(shù)研究者認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的外源激素如6-BA、IAA、IBA、GA3等對(duì)胚的發(fā)育具有促進(jìn)作用[3，29，30，36，54]。不同雜交組合對(duì)6-BA 的敏感程度不同，其中，應(yīng)用較多的添加量為0.5 mg/L[29，30，54]。郭雨瑞[31]研究了多效唑（paclobutrazol，PAC）對(duì)胚挽救效果的影響，結(jié)果顯示，在MM3 培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L 的PAC 可以提高‘火焰無(wú)核×北冰紅’、‘昆香無(wú)核×泰山-2’雜交胚珠的成胚率；在胚萌發(fā)階段，向WPM培養(yǎng)基中添加1 μmol/L 的PAC 可以提高‘紅無(wú)籽露×北冰紅’的發(fā)芽率和成苗率。

在葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也有利于胚珠的發(fā)育。唐冬梅[8]研究表明，花前兩周?chē)娛?00～500 mg/L 的矮壯素能顯著促進(jìn)森田尼無(wú)核胚珠的發(fā)育，提高森田尼無(wú)核胚的萌發(fā)率和最終成苗率。李桂榮[60]發(fā)現(xiàn)，在無(wú)核葡萄坐果過(guò)程中噴施IAA 30 mg/L＋ABA 30 mg/L 可以促進(jìn)漿果內(nèi)胚珠的發(fā)育。朱佩佩[36]研究指出，花前2 周?chē)娛?0～50 mg/L 的6-BA 能夠促進(jìn)雜交組合胚的發(fā)育，這與陶建敏等[61]的研究結(jié)果相一致。

添加多胺（腐胺、精胺、亞精胺）[9，60]、氨基酸（絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺）[3，21]、水解酪蛋白、秋水仙堿、麥芽糖、香蕉泥等，也對(duì)胚的發(fā)育起到一定的促進(jìn)作用。在胚萌發(fā)培養(yǎng)基WPM 中添加3 mmol/L 腐胺有利于‘紅無(wú)籽露×雙優(yōu)’、‘紅寶石無(wú)核×紫香無(wú)核’、‘愛(ài)神玫瑰×陽(yáng)光玫瑰’成苗，成苗率分別提高了13.34%、6.67%和30.16%；添加0.5 mmol/L 亞精胺有利于‘紅寶石無(wú)核×火焰無(wú)核’、‘紅臉無(wú)核×愛(ài)神玫瑰’成苗；添加0.3 mmol/L 精胺有利于‘紅寶石無(wú)核×江西-2’、‘紅無(wú)籽露×紫香無(wú)核’成苗[9]。田淑芬等[3]研究了不同甘氨酸濃度對(duì)胚發(fā)育的影響，認(rèn)為不同雜交組合使用的最佳甘氨酸濃度也不一樣，其中，‘紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系’使用的最適濃度為4.0 mmol/L，‘希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系’使用的最適濃度為1.0 mmol/L。

3.3.3 培養(yǎng)基形態(tài) 胚挽救過(guò)程中培養(yǎng)基的形態(tài)主要有固相、液相和固液雙相3 種。其中，固液雙相培養(yǎng)基彌補(bǔ)了單相培養(yǎng)基的缺陷，既能增大胚珠與培養(yǎng)基的接觸面積，又能避免培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)過(guò)度而導(dǎo)致的濃縮，經(jīng)檢驗(yàn)[32，36，55，56，60]培養(yǎng)效果很好。但也有研究顯示，對(duì)于胚珠較大的品種，3 種相態(tài)培養(yǎng)基的挽救效果差異不大[56]。

3.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)時(shí)的光照、溫度、珠被處理方式等對(duì)無(wú)核葡萄胚挽救也有一定的影響。

無(wú)核葡萄胚挽救時(shí)胚珠培養(yǎng)過(guò)程中是否需要光照，目前研究結(jié)果不完全一致。由于胚在胚珠內(nèi)的發(fā)育是不見(jiàn)光的，于是，唐冬梅等[56]和李桂榮[60]模擬胚在胚珠中的環(huán)境狀態(tài)，比較了暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)（光照與黑暗交替）對(duì)胚發(fā)育的影響，研究結(jié)果均證實(shí)暗培養(yǎng)有利于離體胚的發(fā)育。史文靜等[7]認(rèn)為，暗培養(yǎng)時(shí)間在8～10 周為宜，暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)顯著增加畸形胚的比例。但鄭婷[32]的研究結(jié)果顯示，光照（光照與黑暗交替）培養(yǎng)可以促進(jìn)胚的發(fā)育。李玉玲等[27]探討了不同光質(zhì)（紅光、藍(lán)光、白光、暗）培養(yǎng)對(duì)火焰無(wú)核胚珠培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)4 種光質(zhì)處理對(duì)胚發(fā)育的影響效果差異不顯著。

對(duì)于胚培養(yǎng)過(guò)程中是否都需要低溫，研究者的看法也不一樣。一般認(rèn)為，為打破胚的休眠，促進(jìn)胚萌發(fā)，提高萌發(fā)率和培養(yǎng)壯苗，需對(duì)胚珠進(jìn)行一定時(shí)間的4 ℃低溫處理。鄭婷[32]研究表明，低溫處理‘火焰無(wú)核×寒香蜜’胚珠10 d，可以使胚珠發(fā)育率、胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率均達(dá)到相對(duì)較高的水平。但也有學(xué)者認(rèn)為，由于無(wú)核葡萄的胚未發(fā)育成熟，其并未進(jìn)入休眠狀態(tài)，因此，無(wú)需考慮休眠問(wèn)題。唐冬梅等[56]和田淑芬等[52]的研究結(jié)果均表明，在胚珠離體培養(yǎng)階段低溫培養(yǎng)會(huì)抑制胚的發(fā)育，降低胚發(fā)育率。

在無(wú)核葡萄胚挽救過(guò)程中，珠被的處理方式有不處理（全胚珠）、橫切、縱切、切喙和剝?nèi)÷闩?。多?shù)學(xué)者認(rèn)為，剝?nèi)÷闩呖梢蕴岣吲叩拿劝l(fā)率[62]，使胚提前萌發(fā)且成苗整齊，同時(shí)，可直接判斷胚挽救苗是來(lái)自合子胚還是來(lái)自體細(xì)胞胚。但是，由于不同的品種或雜交組合胚剝離難易程度不一樣，且在剝胚過(guò)程中容易使胚受傷而產(chǎn)生較多的畸形苗，故一些學(xué)者采取橫切[63]、切喙[58]的方式處理珠被，使胚在胚乳和培養(yǎng)基的雙重營(yíng)養(yǎng)下萌發(fā)生長(zhǎng)，同樣可以提高胚珠的萌發(fā)出苗率，并且操作容易，對(duì)胚的傷害小。所以，橫切和切喙的珠被處理方式也被較多學(xué)者所應(yīng)用。

3.5 胚挽救苗的馴化移栽

胚挽救苗的馴化移栽是一個(gè)由半異養(yǎng)到自養(yǎng)、高濕到低濕、恒溫到變溫、無(wú)菌到有菌的過(guò)程[33，64]，是其從實(shí)驗(yàn)室走向大田的關(guān)鍵步驟。李桂榮[60]建立的移栽馴化操作程序?yàn)閺?qiáng)光閉口煉苗7～14 d—移栽至基質(zhì)—罩透明塑料杯保濕煉苗—溫室馴化—移植大田。胚挽救苗的生長(zhǎng)狀況、移栽基質(zhì)和噴施營(yíng)養(yǎng)液等是影響無(wú)核葡萄育種成苗的主要因素。

一般認(rèn)為，苗齡30～40 d 是胚挽救苗移栽的適宜時(shí)期[6，8，33，64]；60 d 時(shí)的試管苗根系已經(jīng)老化，移栽成活率會(huì)大大降低。但是，苗齡并不適合所有的情況，應(yīng)結(jié)合要移栽馴化的胚挽救苗的長(zhǎng)勢(shì)和高度進(jìn)行綜合評(píng)判。李桂榮[60]研究認(rèn)為，苗高8～10 cm 時(shí)是胚挽救苗的最適移栽時(shí)期。

單一的移栽基質(zhì)成分有園土、泥炭土、蛭石、河沙、珍珠巖、椰糠等。一般認(rèn)為，應(yīng)用復(fù)配基質(zhì)的效果優(yōu)于應(yīng)用單種特定的移栽基質(zhì)。實(shí)踐中應(yīng)用的復(fù)配基質(zhì)配方有V（珍珠巖）∶V（蛭石）∶V（河沙）＝1∶1∶1[33]、V（珍珠巖）∶V（草炭）∶V（園土）＝4∶1∶1[6]、V（珍珠巖）∶V（草灰）＝1∶1[62]、V（基質(zhì)土）∶V（蛭石）＝5∶1[7]、V（蛭石）∶V（泥炭土）∶V（椰糠）＝1∶4∶1[60]，V（椰糠）：V（蛭石）∶V（腐葉土）＝2∶1∶1[65]。馴化移栽時(shí)常用的營(yíng)養(yǎng)液為B5 和MS。對(duì)營(yíng)養(yǎng)液濃度進(jìn)行比較后，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，用1/8 MS大量元素[8，24，33，60]營(yíng)養(yǎng)液澆灌胚挽救苗利于壯苗，有助于移栽成活率的提高；也有人認(rèn)為，應(yīng)用更低濃度的1/10 MS[60]或1/16 MS[6]營(yíng)養(yǎng)液對(duì)胚挽救苗的移栽馴化有利且經(jīng)濟(jì)。唐冬梅[8]用1/4 B5 大量元素溶液澆灌移栽苗，幼苗的成活和生長(zhǎng)效果較好。

生根粉屬于生長(zhǎng)素類(lèi)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，生長(zhǎng)素能調(diào)控側(cè)根根原基的形成，促進(jìn)植物側(cè)根和不定根的發(fā)生與生長(zhǎng)，并且側(cè)根的發(fā)生與伸長(zhǎng)都直接或間接地依賴(lài)于生長(zhǎng)素的調(diào)控作用[59]。用300 mg/L 生根粉浸根20～30 s[33]或用1.0 mg/L 生根粉浸根3 min[59]處理幼苗，移栽成活率較高。

4 展望

我國(guó)在葡萄育種中應(yīng)用胚挽救技術(shù)已有30 余年的歷史，在無(wú)核葡萄胚挽救影響因素方面以及三倍體育種、遠(yuǎn)緣雜交育種和抗性育種等方面進(jìn)行了系列研究，建立了無(wú)核葡萄胚挽救技術(shù)體系，創(chuàng)制了很多無(wú)核葡萄新種質(zhì)，并育成一些無(wú)核葡萄新品種。但與國(guó)外引進(jìn)品種相比，我國(guó)的這些育成品種在商品性上缺乏突破；且多數(shù)品種都是由2 個(gè)外來(lái)或古老種質(zhì)的簡(jiǎn)單雜交獲得，缺少多親多代綜合雜交育成的品種[66]。這一狀況與我國(guó)擁有眾多栽培品種和豐富野生葡萄資源的事實(shí)不相符。我國(guó)野生葡萄中的一些種和株系具有較強(qiáng)的抗病、抗逆性，現(xiàn)有研究表明其基因組存在主效抗病基因，且與歐洲葡萄無(wú)核品種雜交易親和，因此，在對(duì)葡萄重要性狀的遺傳規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，充分利用我國(guó)的葡萄資源，應(yīng)用胚挽救技術(shù)與傳統(tǒng)雜交育種等手段，選育具有大粒、無(wú)核、抗性強(qiáng)等優(yōu)良性狀的葡萄新品種仍是目前育種工作者不斷探索和研究的重點(diǎn)。

利用胚挽救技術(shù)得到的F1代雜種中還存在一定比例的有核雜種，尤其是利用有核葡萄做父本時(shí)。利用分子標(biāo)記對(duì)F1代雜種進(jìn)行無(wú)核、抗性性狀的早期篩選，能夠提高育種效率，節(jié)省大量人力、物力、財(cái)力。迄今，已有5 個(gè)無(wú)核基因分子標(biāo)記被用于葡萄無(wú)核性狀的輔助選擇，分別是SCAR 標(biāo)記SCC8、SCF27 和GSLP1-569，微衛(wèi)星標(biāo)記VMC7F2 和p3-VvAGL11[4，67]。在抗病性方面應(yīng)用的分子標(biāo)記有許多，如，抗炭疽病基因PAPD 標(biāo)記OPC15-1300，抗黑痘病基因RAPD 標(biāo)記OPS03-1354，抗霜霉病基因RAPD 標(biāo)記S294 和S382，抗白粉病基因RAPD 標(biāo)記OPW02-1756 等。在抗寒性方面應(yīng)用的分子標(biāo)記有S241-717 和S238-854。由于分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度、適用的廣泛性等影響著輔助選擇的效率，因此，繼續(xù)尋找緊密連鎖的無(wú)核基因分子標(biāo)記以及抗病和抗逆基因分子標(biāo)記，仍是今后葡萄分子育種的重要內(nèi)容。