高遷移率族蛋白B1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖、分化影響的體外研究

徐賢寅 朱金曉 朱文婷 李曉丹

江蘇省無(wú)錫市兒童醫(yī)院口腔科 214023

高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1) 是一種具有高度保守性的DNA 結(jié)合蛋白，它在許多種細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，對(duì)細(xì)胞核的穩(wěn)定、DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等功能具有重要的調(diào)控作用[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在特定的情況下，能被主動(dòng)或被動(dòng)地釋放到細(xì)胞外，具有類(lèi)似于炎癥因子的作用，發(fā)生一系列生物學(xué)反應(yīng)。人體的牙周組織具有極強(qiáng)的自我修復(fù)能力,這種能力來(lái)源于牙周膜內(nèi)的一種未分化間充質(zhì)細(xì)胞，其具有干細(xì)胞的特性，能自我更新并多向分化，故被稱(chēng)之為牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)[2-3]。一般情況下，牙周膜干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，以維持牙周膜的穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)受到外界刺激時(shí)其隨之發(fā)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致牙周組織的改變。筆者通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察HMGB1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞生物反應(yīng)的影響，探討HMGB1在人牙周組織反應(yīng)中的作用，以期為臨床上牙周炎的控制找到一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 材料與試劑

(1)主要試劑：高遷移率族蛋白B1 (R&D 公司,美國(guó))；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；引物由上海吉瑪公司合成；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉(Sigma公司,美國(guó))；Ⅰ型膠原酶(Gibco公司，美國(guó))。(2)主要材料：人牙周膜干細(xì)胞通過(guò)酶解組織法獲得并采用有限稀釋克隆法純化。

2 方法

2.1 人牙周膜干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 收集臨床上健康青年(20～25歲)拔除的牙周健康、無(wú)齲的新鮮第三磨牙，放無(wú)菌臺(tái)上，液漂洗3～5次，刮下根中1/3牙周膜，在含有2mg/mlⅠ型膠原酶的溶液中消化30min，離心后去上清，移入25ml培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中孵育。3d后開(kāi)始每2～3d更換培養(yǎng)液1次，7～10d把組織去掉，收獲人牙周膜干細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，離心、過(guò)濾后，與培養(yǎng)基以1∶1比例混合培養(yǎng)，融合達(dá)到80%，用胰蛋白酶消化，作傳代培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第1代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5 000個(gè)/cm2，接種于96孔培養(yǎng)板中(1 500個(gè)/cm2細(xì)胞)。5d后換液，光鏡下觀察克隆形成情況。常規(guī)培養(yǎng)7～14d，至出現(xiàn)細(xì)胞克隆(細(xì)胞數(shù)≥50為判定標(biāo)準(zhǔn))，待克隆長(zhǎng)至孔底1/3～1/2后胰酶消化，轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HMGB1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)的第三代人牙周膜干細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。分成3組，兩組中分別更換含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培養(yǎng)液，另一組作為空白對(duì)照。經(jīng)HMGB1誘導(dǎo)培養(yǎng)后，分別在第1、3、5天取出1塊培養(yǎng)板，用MTT檢測(cè)試劑盒分析人牙周膜干細(xì)胞的增殖能力。操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)人牙周膜干細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá) 取培養(yǎng)的第三代人牙周膜干細(xì)胞，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育24h。分成3組，兩組中分別更換含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培養(yǎng)液，隔天換液，保證HMGB1濃度，另一組作為空白對(duì)照。經(jīng)HMGB1誘導(dǎo)7d后，采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，20μl體系反轉(zhuǎn)錄1 000ng RNA，進(jìn)行相關(guān)基因的RT-PCR反應(yīng)：增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、白細(xì)胞介素-1b(IL-1b)、 腫瘤壞死因子α(TNFα)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，各引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP的引物序列

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS21進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)間進(jìn)行比較分析，P<0.05顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HMGB1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)100ng/ml和200ng/ml的HMGB1誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞后，第3天和第5天經(jīng)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，兩實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的OD值有明顯升高(P<0.05)(圖1)，實(shí)驗(yàn)組間比較OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明HMGB1對(duì)hPDLSCs有促進(jìn)增殖作用。經(jīng)100ng/ml HMGB1誘導(dǎo)7d后，鏡檢顯示人牙周膜干細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞增殖活躍，見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度HMGB1誘導(dǎo)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的增殖作用

圖2 100ng/ml HMGB1誘導(dǎo)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的增殖作用

注：A.誘導(dǎo)前，B.誘導(dǎo)7d后。

3.2 HMGB1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞中PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP基因表達(dá)的影響 兩種濃度的HMGB1(100和200ng/ml)誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞后，在第7天采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組中PCNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)(圖3)，提示100和200ng/ml的HMGB1誘導(dǎo)使hPDLSCs的具有旺盛的增殖活性；同樣IL-1b、TNFα和TRAP的表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4～6，說(shuō)明100和200ng/ml的HMGB1誘導(dǎo)對(duì)hPDLSCs的破骨作用有明顯提高。

4 討論

與組蛋白類(lèi)似，高遷移率族蛋白也是最重要的染色質(zhì)蛋白之一。在細(xì)胞核中，HMGB1與核小體、轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白相互作用，調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄。HMGB1在許多轉(zhuǎn)錄因子的相互作用中支持多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞復(fù)制、分化等重要生命活動(dòng)。HMGB1存在于細(xì)胞核中的但當(dāng)賴(lài)氨酸殘基上的過(guò)乙酰化可使它轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中。1999年，Wang等[4]發(fā)現(xiàn)HMGB1可以被釋放到胞外，局部出現(xiàn)類(lèi)似于炎癥因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。隨后，HMGB1作為一種炎癥介質(zhì)或促炎細(xì)胞因子逐步進(jìn)入人們的視線，有研究表明HMGB1參與人體多種疾病的發(fā)展，如自身免疫性疾病，肺炎、糖尿病、腫瘤等[5-6]。

隨著對(duì)HMGB1的深入研究，HMGB1在牙周組織中的反應(yīng)情況進(jìn)入了口腔科醫(yī)生的視線。牙周炎是口腔內(nèi)最常見(jiàn)的疾病之一，主要表現(xiàn)為牙周組織的慢性炎癥。通過(guò)對(duì)齦溝液成分的研究發(fā)現(xiàn)，作為一種外泌性炎癥介質(zhì)，HMGB1在牙周炎患者的齦溝液的含量明顯增加，而健康人的齦溝液中則沒(méi)有變化[7]。筆者在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，齦溝液HMGB1 含量與牙槽骨吸收呈正相關(guān)性。成纖維細(xì)胞是牙周膜中最主要的細(xì)胞，參與牙周組織的一系列生理反應(yīng)。孫欽峰等[8]通過(guò)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能影響其細(xì)胞表面白細(xì)胞介素-6(IL-6)、破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子(RANKL)、骨保護(hù)因子(OPG)的表達(dá)，改變RANKL/OPG比值。

圖3不同濃度HMGB1誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞中PCNA的表達(dá) 圖4 不同濃度HMGB1誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞中IL-1b值不同 圖5不同濃度HMGB1誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞中TNFα的表達(dá) 圖6 不同濃度HMGB1誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞中TRAP的表達(dá)

牙周膜干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞中較年輕的一員,于2004年首次由Seo 等[9]獲得，它平時(shí)在牙周膜組織處于靜息狀態(tài),維持牙周組織穩(wěn)態(tài),當(dāng)局部因素導(dǎo)致牙周膜損傷時(shí)，這些干細(xì)胞能增殖、分化，促進(jìn)牙周組織修復(fù)、再生。本實(shí)驗(yàn)中MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，人牙周膜干細(xì)胞在HMGB1的誘導(dǎo)下，在第3天、第5天已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的增殖反應(yīng)，提示牙周組織在炎癥情況下，HMGB1能引起人牙周膜干細(xì)胞增殖。細(xì)胞因子PCNA是一種位于細(xì)胞核內(nèi)的DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其變化情況與DNA的合成有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)中人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)HMGB1誘導(dǎo)后，第7天RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)hPDLSCs處于旺盛的增殖狀態(tài)。

IL-1是一種多功能細(xì)胞因子，在牙周組織中能通過(guò)介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨吸收和膠原降解，促進(jìn)牙周炎進(jìn)一步發(fā)生，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落[11]。TNF是一種內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子，與感染性疾病密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)牙周炎患者的檢查發(fā)現(xiàn)，在其牙周組織中以及齦溝液中檢測(cè)到大量的TNF，其含量的高低與牙周炎的活躍程度相關(guān)，其含量越高牙周組織的破壞程度越嚴(yán)重[12]。TRAP是破骨細(xì)胞的特征性酶，TRAP參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物的降解，其表達(dá)和分泌與破骨細(xì)胞功能密切關(guān)系，調(diào)控TRAP的表達(dá)促進(jìn)破骨過(guò)程，減少成骨[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)HMGB1誘導(dǎo)后，第7天IL-1、TNF表達(dá)明顯增加，說(shuō)明其能促進(jìn)炎癥反應(yīng)；TRAP表達(dá)的明顯增加，提示細(xì)胞的破骨功能得到加強(qiáng)。

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，人牙周膜干細(xì)胞能被HMGB1刺激發(fā)生增殖，使得局部炎癥反應(yīng)放大，同時(shí)破骨作用也得到了加強(qiáng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：HMGB1在牙周組織的破壞中起到重要作用。如何利用HMGB1作為靶點(diǎn)進(jìn)行牙周炎癥控制，同時(shí)促進(jìn)牙周組織修復(fù)再生，需要在今后的工作中進(jìn)行更深入的研究。