新塔花水提物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠IL-1β和TNF-α水平的影響

張 華， 蘭 衛(wèi),2， 馬學(xué)寬， 張選明， 安冬青,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830000)

新塔花(ZiziphoraclinopodioidesLam.)為唇形科半灌木狀植物新塔花的地上部分,在我國(guó)主要分布于新疆，內(nèi)蒙古等地區(qū)[1]。新塔花的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、總黃酮、生物堿、維生素等[2]。Behravan等[3]采用GC和GC-MS法對(duì)伊朗產(chǎn)地新塔花揮發(fā)油行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中含有27種成分，主要包括胡薄荷酮(44.5%)、萜品醇(14.5%)等。研究表明，新塔花揮發(fā)油中胡薄荷酮具有良好的抗炎作用[4-7]。研究表明新塔花中的總黃酮具有抗氧化性、舒張血管、抗炎止痛的功效[8-9]，臨床上多用于治療失眠多夢(mèng)、胃腸道和心腦血管疾病的治療[10-13]。目前關(guān)于新塔花治療動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的研究報(bào)道較少，本研究采用HE染色法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)新塔花防治AS的炎癥機(jī)制進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只8 w齡雄性ApoE-/-小鼠，10只8 w齡C57小鼠，體質(zhì)量(19±1)g，C57BL/6J品系，購(gòu)于北京維通利華公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：20171129-02。

1.2 儀器BS124S型電子天平(上海精科天平公司)，PM-401型石蠟熔蠟箱日本(SAKURA公司)， LKB-V型切片機(jī)(瑞典LKB公司)，5810R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendrof公司)，DM2500光學(xué)顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)，Type1500型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 試藥阿托伐他汀(北京Solarbio公司,批號(hào)20151223)，HE染色試劑盒(北京Solarbio公司,批號(hào)G1120)，小鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技公司,批號(hào)ML037211)，小鼠IL-1β ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技公司,批號(hào)ML063132)。新塔花全草(亳州市中正中藥材飲片有限公司,批號(hào)160801)。

1.4 方法

1.4.1 新塔花水提物的制備 稱取芳香新塔花藥材2份，每份24 g，粉碎后分別置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，加熱回流提取2 h,過(guò)濾，洗滌濾渣，將所得濾液真空旋蒸濃縮， 1份定容至100 mL即得新塔花高劑量溶液(含生藥0.18 g/mL)，另一份定容至200 mL即得新塔花低劑量溶液(含生藥0.09 g/mL)。

1.4.2 動(dòng)物模型的建立 將所有小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)1 w，不限飲食飲水，自由活動(dòng)，建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料82.68%，豬油10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心加工而成。

1.4.3 動(dòng)物的分組及給藥 將建模后的ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組(0.4 mL/10 g體質(zhì)量,蒸餾水)，阿托伐他汀組(3 mg/kg體質(zhì)量, 阿托伐他汀)，新塔花高劑量組(1.8 g/(kg體質(zhì)量, 新塔花高劑量溶液)、新塔花低劑量組(0.9 g/kg體質(zhì)量, 新塔花低劑量溶液)，建模后的C57小鼠為空白組(0.4 mL/10 g體質(zhì)量,蒸餾水)，每組10只，每天灌胃1次，連續(xù)12 w,每周記錄小鼠體質(zhì)量變化，并調(diào)整用藥量，小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量公式: [g/(kg·d)]=9.1×成人臨床常藥量[g/(kg·d)]。

1.4.4 標(biāo)本采集 各組小鼠灌胃12 w末禁食不禁水12 h后，麻醉后眼球取血，置于1.5 mL EP管中，7 500 r/min離心15 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫辉跓o(wú)菌條件打開(kāi)小鼠胸腹腔，取主動(dòng)脈根部至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈組織，生理鹽水沖洗，胸主動(dòng)脈用10%甲醛固定，用于HE染色；其余主動(dòng)脈放置凍存管迅速投入液氮后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。

1.4.5 HE染色 取由甲醛固定的胸主動(dòng)脈，依次經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進(jìn)行切片，每個(gè)組織連續(xù)切片5 μm厚度，取6張效果較好的切片；HE染色后在光鏡下觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)變化。

1.4.6 ELISA法測(cè)血清中IL-1β和TNF-α水平 采用ELISA技術(shù)檢測(cè)，按照試劑盒操作說(shuō)明，依次加樣、溫育、配液洗滌、拍干、加酶、顯色、終止等步驟，測(cè)定小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況及體質(zhì)量變化灌胃第12 w末，空白組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，易躁好斗，皮毛光潔，飲食飲水正常，大便干結(jié)正常，體質(zhì)量無(wú)變化。與空白組比較，模型組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜靜少動(dòng)，皮毛干枯無(wú)澤，出現(xiàn)脫落，飲食飲水量減少，大便黏膩，體質(zhì)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，阿托伐他汀組、新塔花高劑量組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，均表現(xiàn)喜靜少動(dòng)，皮毛干枯無(wú)澤，出現(xiàn)脫落，飲食飲水量減少，大便黏膩，體質(zhì)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；新塔花低劑量組小鼠，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜靜少動(dòng)，皮毛干枯無(wú)澤，出現(xiàn)脫落，飲食飲水量減少，大便黏膩，體質(zhì)量升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化小鼠主動(dòng)脈HE染色表明,空白組小鼠血管壁幾乎無(wú)脂質(zhì)沉積，管腔無(wú)明顯狹窄。模型組小鼠血管壁增厚,出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。新塔花低劑量組小鼠血管壁增厚，內(nèi)部脂質(zhì)沉淀和斑塊略低于模型組，管腔有狹窄。新塔花高劑量組小鼠AS斑塊面積小于模型組，大于空白組。阿托伐他汀組小鼠血管腔狹窄不明顯，AS斑塊面積小于模型組，血管損傷較小，脂質(zhì)沉積少，見(jiàn)圖1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

注：與空白組比較，*P<0.01； 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

A:空白組B:模型組C:阿托伐他汀組E:新塔花高劑量組 F:新塔花低劑量組

圖1 各組小鼠胸主動(dòng)脈病理切片圖(HE ×100)

2.3 各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比較與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-ɑ、IL-1β含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，阿托伐他汀組、新塔花高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠TNF-α和IL-1β表達(dá)水平

注：與空白組比較，*P<0.01； 與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病(CVD)的主要病理基礎(chǔ)，由AS引起的心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，尤其是在中老年人群的常見(jiàn)病，已經(jīng)成為全球人口死亡的首要原因，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。截至目前，我國(guó)的CVD現(xiàn)患人數(shù)約3億,死亡率居各病因首位,占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，包括脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮功能障礙學(xué)說(shuō)等。上世紀(jì)末，Ross R首先提出AS炎癥學(xué)說(shuō)；2017年 ESC年會(huì)公布了CANTOS研究結(jié)果證實(shí)通過(guò)AS抗炎治療能夠有效降低CVD發(fā)病率，該研究結(jié)果宣告了AS的治療進(jìn)入新時(shí)代[14-15]。

中醫(yī)根據(jù)AS病變部位和臨床表現(xiàn)，大致將其歸于“胸痹”、 “眩暈”、“脈痹”等范疇，主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。天香丹具有調(diào)節(jié)血脂水平，改善心肌缺血，抑制炎癥反應(yīng)等功效。新塔花作為其主藥，具有抗炎、抗氧化性和心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,新塔花能夠改善小鼠主動(dòng)脈病理狀況，延緩小鼠體質(zhì)量增加，降低小鼠血清TNF-α和IL-1β含量。提示新塔花水提物具有一定的抗炎效果，但具體是新塔花中的哪些成分起到了抗炎作用尚不明確，仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。