HBV陽性孕婦CD209/CD209L基因多態(tài)性與宮內(nèi)感染的相關(guān)性研究

謝曉彬， 曾 艷， 鄧曉華， 楊志宏

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 深圳 518100)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起乙型肝炎的病原體，在世界范圍約有20億感染者，其中超過3.5億人是HBV攜帶者，15%～40%的感染者會發(fā)展為肝功能衰竭、肝硬化或肝癌，每年導(dǎo)致約100萬人的死亡[1]。血液和血液制品傳染、密切接觸傳染、醫(yī)源性傳染、母嬰傳染(宮內(nèi)，分娩，母乳喂養(yǎng))是HBV感染的主要途徑，其中母嬰傳染約占HBV傳染的50%。孕婦將HBV傳染給子代，主要發(fā)生在3個時期：產(chǎn)前、產(chǎn)時和產(chǎn)后。產(chǎn)前傳染，也就是宮內(nèi)傳染，即乙肝病毒通過胎盤感染胎兒[2]。在我國乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性孕婦的宮內(nèi)感染率在15%～25%[3]。目前對HBV宮內(nèi)感染的機理仍有待研究，但已證實遺傳易感性和各種母體特征(即分娩方式，流產(chǎn)史，產(chǎn)前出血，母體HBV DNA載量和妊娠期HBV感染的血清標(biāo)志物)均對宮內(nèi)感染有影響[4-5]。樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM)-3抓取非整合素(CD209)和肝/淋巴結(jié)特異性ICAM-3抓取非整合素(CD209L)是都是跨膜C型凝集素，是鈣依賴性碳水化合物結(jié)合蛋白，可以充當(dāng)細(xì)胞粘附和病原體識別受體[6-8]。 研究表明CD209/CD209L可通過C-末端C-型碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域捕獲人類免疫缺陷、埃博拉、乙型肝炎、登革熱、巨細(xì)胞、SARS冠狀等多種病毒[9-10]。本研究對HBV陽性孕婦CD209/CD209L基因多態(tài)性與宮內(nèi)感染的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2016年1月-2018年6月在深圳市龍崗中心醫(yī)院婦產(chǎn)科接生的HBV陽性孕婦110例為研究對象，根據(jù)新生兒是否出現(xiàn)宮內(nèi)感染(以新生兒出生時注射乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白前抽取新生兒股靜脈血檢測 HBsAg≥0.05 IU/mL、HBV DNA>103 copy/mL為診斷HBV宮內(nèi)感染的指標(biāo))分為感染組60例和非感染組50例。2組孕婦在年齡、孕周、HBV DNA等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究按照赫爾辛基宣言進(jìn)行，經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，孕婦參與前均簽署書面知情同意書。

1.2 CD209、CD209L單核苷酸多態(tài)性的檢測

1.2.1 血液中DNA樣品的提取純化 2組孕婦肱靜脈抽血4 mL，加入EDTA-K2抗凝，5 000 r/min 離心5 min，棄除血清后加入人紅細(xì)胞裂解液300 μL, 混勻震蕩3 min,10 000 r/min 離心30 s，取400 μL裂解物置于含有20 μL蛋白酶K的2 mL微量離心管中，56℃溫育10 min后，加入400 μL乙醇混勻。取700 μL混合物置于QIAamp旋轉(zhuǎn)柱以8 000 r/min離心1 min，將QIAamp旋轉(zhuǎn)柱置于2 mL收集管中，棄去濾液。重復(fù)離心步驟后，將500 mL AW1緩沖液加入旋轉(zhuǎn)柱中，8 000 r/min離心1 min，將500 mL AW2緩沖液加入旋轉(zhuǎn)柱中，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp Spin Column置于1.5 mL微量離心管中，加入150 μLAE緩沖液，室溫下孵育1 min后，以8 000 r/min離心1 min，將純化的DNA保存在-20℃冰箱中，備用。

1.2.2 CD209 SNP位點CD209、CD209L DNA的擴增 CD209 SNP位點的 PCR 擴增引物和單堿基延伸引物為正向5“-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3”和反向5“GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3”。 CD209L SNP位點的 PCR擴增引物和單堿基延伸引物為正向5“-ATCGTGACTTAGACTACTACCAAGCT-3”和反向5“GTCGTTCTGAAAAAGCATTCCTTAA-3”。參照Platinum Taq PCR試劑盒(美國Applied Biosystems公司)操作說明進(jìn)行反應(yīng)，將96微孔板置于GeneAmp PCR System 9700型酶標(biāo)儀(美國Applied Biosystems公司)按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃1 min，然后30個循環(huán)95℃30 s，55℃30 s，和72℃ 30 s。

1.2.3 CD209、CD209L單核苷酸多態(tài)性檢測 將8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)限制酶過夜消化，采用4%瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(BMA，Rockland，ME，USA)分析確定CD209、CD209L單核苷酸的多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多態(tài)性位點的基因型與感染風(fēng)險的關(guān)系采用χ2檢驗，多態(tài)性位點的基因型頻率與感染風(fēng)險的關(guān)系采用二元Logistic 回歸分析，以O(shè)R和95%CI表示相對風(fēng)險度，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209 77、55基因型比例比較與非感染組CD209 77、55基因型比例(42.0%、48.0%)比較，感染組CD209 77、55基因型比例(45.0%、48.2%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209 77基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.055，95CI%=0.759 0～1.466 5，P>0.05),見表1。

2.2 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209 7、5等位基因頻率比較與非感染組CD209 7等位基因型頻率(50.0%)比較，感染組CD209 7等位基因型頻率(48.3%)降低， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209 5等位基因型頻率(50.0%)比較，感染組CD209等位基因型頻率(51.7%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209 7等位基因頻率不能增加過宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.968，95CI%=0.745～-1.257，P>0.05)，見表2。

表1 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209 77、75、55基因型比例比較/例(%)

表2 非感染組、感染組HBV陽性孕婦 CD209 7、5等位基因頻率比較/例(%)

2.3 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 77、75、55基因型比例比較與非感染組CD209L 77基因型比例(36.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(66.7%)升高， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與非感染組CD209L 55基因型比例(54.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(18.3%)降低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD209L77基因型能增加過宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.920，95%CI=1.269～2.904，P<0.05)，見表3。

表3 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 77、75、55基因型比例比較/例(%)

注：與非感染組比較，*P<0.05。

2.4 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 7、5等位基因頻率比較與非感染組CD209L 7等位基因頻率(40.0%)比較，感染組CD209L 7等位基因頻率(73.3%)升高， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與非感染組CD209L 5等位基因頻率(60.0%)比較，感染組CD209L 5等位基因頻率(26.7%)降低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD209L 7等位基因頻率能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=2.25，95%CI=1.606～3.152，P<0.05), 見表4。

表4 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 7、5等位基因頻率比較/例(%)

注：與非感染組比較，*P<0.05。

2.5 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 99、97、77基因型比例比較與非感染組CD209L 99基因型比例(48.0%)比較，感染組CD209L 99基因型比例(43.0%)降低， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209L 77基因型比例(38.0%)比較，感染組CD209L 77基因型比例(40.0%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 99基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.059，95%CI=0.782～1.433，P>0.05)，見表5。

表5 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 99、97、77基因型比例比較/例(%)

2.6 非感染組、感染組HBV陽性孕婦 CD209L 9、7各等位基因頻率比較與非感染組CD209L 9等位基因頻率(56.0%)比較，感染組CD209L 9等位基因頻率(51.7%)降低， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與非感染組CD209L 7等位基因頻率(44.0%)比較，感染組CD209L 7等位基因頻率(49.3%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 9等位基因頻率不能增加過宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.103，95%CI=0.860～1.416，P>0.05),見表6。

2.7 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 66、65、55基因型突變型比較與非感染組CD209L 66、55基因型比例(56.0%、30.0%)比較，感染組CD209L 66、55基因型比例(56.6%、30.3%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 66基因型不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.957，95%CI=0.819～1.549，P>0.05),見表7。

表6 非感染組、感染組HBV陽性孕婦 CD209L 9、7等位基因頻率比較/例(%)

表7 非感染組、感染組HBV陽性孕婦CD209L 66、65、55基因型突變型比較/例(%)

2.8 非感染組、感染組HBV陽性孕婦 CD209L 6、5等位基因頻率比較與非感染組CD209L 6、5等位基因頻率(68.0%、32.0%)比較，感染組CD209L 77、55等位基因頻率(69.0%、35.0%)升高， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD209L 6等位基因頻率不能增加過宮內(nèi)感染風(fēng)險，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.841、95%CI=0.934～1.369，P>0.05),見表8。

表8 非感染組、感染組HBV陽性孕婦 CD209L 6、5等位基因頻率比較/例(%)

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人類基因組中最常見的遺傳變異形式，其中一部分對人體對疾病易感性有影響，樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)黏附分子基因多態(tài)性在疾病易感性中具有相當(dāng)大的作用。與構(gòu)成膜結(jié)合模式識別受體的樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)黏附分子基因家族的其他成員不同，CD209和CD209L主要位于細(xì)胞內(nèi)吞區(qū)室； CD209識別病毒衍生的dsRNA以及poly C(1種合成的dsRNA類似物)，CD209L識別細(xì)菌和病毒中存在的未甲基化的CpG基序。CD209通過使用含有CD209-IL1R結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)干擾素-β(TRIF)通過髓樣分化初級應(yīng)答蛋白88(MyD88)非依賴性途徑介導(dǎo)其功能效應(yīng)，通過誘導(dǎo)干擾素導(dǎo)致抗病毒活性和/或凋亡和caspase招募。而CD209L通過MyD88依賴性途徑起作用，導(dǎo)致NF-κB活化，細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)[11-13]。

存在于染色體4上的CD209基因的外顯子7/5多態(tài)性通過改變CD209胞外域和功能而影響受體-配體相互作用。CD209 7/5多態(tài)性存在于CD209基因的外顯子2中，并且可能影響mRNA水平的表達(dá)。CD209通過MyD88依賴性途徑起作用，導(dǎo)致NF-κB活化，細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)。具有DNA基因組的病毒，例如HBV病毒，可能潛在地激活CD209，其響應(yīng)于CpG DNA而被激活，以誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)。有研究評估CD209(7/5)基因多態(tài)性與日本、德國、美國HBV孕婦宮內(nèi)感染易感性之間的關(guān)聯(lián)，CD209(7/5)等位基因頻率分別為34.0%、55.4%和57.0%，表明宿主遺傳因素在個體間差異與疾病易感性方面的相關(guān)性[14-15]，這與本次研究顯示CD209 77基因型、 CD209 7等位基因頻率不能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險的結(jié)果相一致。

本研究表明，CD209L77基因型、CD209L 7等位基因頻率能增加宮內(nèi)感染風(fēng)險，說明CD209L 77基因型與HBV宮內(nèi)感染結(jié)局相關(guān)[16-17]。該特定CD209L 77基因型在HBV宮內(nèi)感染中的功能意義的表征可提供導(dǎo)致新型預(yù)防和治療方法的發(fā)展的見解。仍需要進(jìn)一步研究來驗證這些發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步探討HBV宮內(nèi)感染與易感基因之間的關(guān)系，以及可能與HBV宮內(nèi)感染有關(guān)的任何其他風(fēng)險因素。本研究結(jié)果同時也提示CD209、CD209L 9/7、CD209L 6/5等位基因突變與HBV宮內(nèi)感染無關(guān)。