右美托咪定對病理性神經(jīng)痛坐骨神經(jīng)卡壓性模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響

韓 梅， 趙 昭， 馮 軍

(深圳市第二人民醫(yī)院麻醉科， 深圳 518035)

P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)屬于MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)家族一員,最新疼痛研究進展表明，P38MAPK參與了疼痛的發(fā)生發(fā)展，此外，還參與脊髓背膠神經(jīng)元興奮過程。有研究表明，坐骨神經(jīng)分支卡壓性模型建立后，其P38MAPK水平會明顯降低[1]。目前，在病理性神經(jīng)痛治療中，常用的藥物主要為抗癲癇類藥、三環(huán)類抗抑郁藥以及去甲狀腺素再攝取抑制藥。以往研究認為，疼痛是機體組織在一定程度上受損或存在潛在性損傷造成的，可提示患者出現(xiàn)健康問題[2]。隨著對疼痛研究的深入，有學者提出，疼痛不僅僅是一類疾病，亦是神經(jīng)功能紊亂的一種表現(xiàn)[3]。徐玉英等[4]實驗發(fā)現(xiàn)，在疼痛發(fā)生的初始階段，會有脊髓小膠質(zhì)細胞激活現(xiàn)象，隨著損傷的恢復，膠質(zhì)細胞水平亦隨之下降。基于此有學者提出，小膠質(zhì)細胞ATP受體激活可能是通過P38MAPK通路實現(xiàn)的[5]。右美托咪定是一種新型的α2腎上腺素激動藥，因其對中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用而被廣泛應用于臨床。鞘內(nèi)注射用藥能夠抑制去甲腎上腺素的生成以及分泌，緩解神經(jīng)病理性疼痛。本研究旨在探究右美托咪定對病理性神經(jīng)痛坐骨神經(jīng)卡壓性模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD雄性大鼠36只，體重220～265 g，按照隨機數(shù)字表法將其分為3組(對照組、病理性神經(jīng)痛模型組、右美托咪定組)，每組各12只，均進行分籠飼養(yǎng)，且保持清潔干凈，室溫控制在25℃左右。36只大鼠自由飲食、飲水，每天進行墊料更換。

1.2 實驗器材冰箱(購于海爾公司)；顯微鏡(購于日本奧林巴斯公司)；恒溫水浴箱(購于日本三洋公司)；離心機(購于Sigma公司)；PCR儀(購于RAKARA公司)；電泳儀(購于上海天能公司)。

1.3 主要試劑與藥品PT-PCR引物(購于上海寶曼生物科技有限公司)；兩步法qRT-PCR試劑盒(購于Biomiga公司)；組織RNA提取試劑盒(購于Biomiga公司)；DEPC(購于Solarbio Life Science公司)；5×TBE緩沖液(購于鵬博生物有限公司)；多聚甲醛(購于武漢博士德有限公司)；兔源性P38MAPK單克隆抗體(購于廣州東盛科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 對照組大鼠進行假手術(shù)處理，切開肌層并進行坐骨神經(jīng)分離。病理性神經(jīng)痛模型組大鼠進行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，并建立病理性坐骨卡壓性損傷模型,隨后每天向鞘內(nèi)注射2 μg/kg的生理鹽水，共注射14 d。右美托咪定組大鼠進行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，建立病理性坐骨卡壓性損傷模型,隨后每天向鞘內(nèi)注射2 μg/kg的右美托咪定，用5 mL注射器抽取5 mL生理鹽水，注入1 mL然后回抽1 mL再注入, 如此反復待生理鹽水變?yōu)榧t色混濁后重復操作, 直至置換液為淡紅色。觀察各組大鼠熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射潛伏期,并用免疫組織化學法測定脊髓背根神經(jīng)節(jié)P38MAPK表達情況，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應檢測P38MAPKA mRNA表達水平[6]。

1.4.2 熱縮足與機械縮足測定方法 (1)熱縮足測定方法：將所有大鼠放置于有機玻璃箱內(nèi)，并將3 mm厚的玻璃板置于箱子底部。待其適應后，采用熱痛儀對大鼠足底第2、3趾間皮膚進行照射，共照射3次，每2次間相隔6 min，且每次時間上限為15 s，照射光斑直徑<8 mm[7]。記錄每次大鼠回避時間，取3次平均值為最終結(jié)果。(2)機械縮足測定方法：將所有大鼠放置于有機玻璃箱中，將每格1 mm2的不銹鋼絲置于箱底，待15 min大鼠適應后，使用不同折力對大鼠進行垂直刺激，力量應由小至大，每次刺激維持6～8 s，對大鼠刺激時狀態(tài)進行觀察[8]。若大鼠有明顯縮足表現(xiàn)，或者表現(xiàn)為舔足，則認為其為陽性。連續(xù)2次刺激時間間隔12 s，連續(xù)刺激10次，若陽性反應為5次或5次以上，則記作50%反應率[9]。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠一般行為變化實驗過程中，所有大鼠飲水、飲食正常，無生病、死亡現(xiàn)象。所有大鼠在坐骨神經(jīng)分離處理后，均出現(xiàn)損傷同側(cè)腳趾并攏或內(nèi)收，伴隨或不伴隨自發(fā)性甩腿、舔足、踮地行走等疼痛表現(xiàn)，說明造模成功。與對照組比較，病理性神經(jīng)痛模型組與右美托咪定組上述表現(xiàn)均有所減少。

2.2 3組大鼠熱縮足反射潛伏期比較術(shù)前，3組大鼠熱縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；右美托咪定組術(shù)后1、3、7 d 熱縮足反射潛伏期均高于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)，低于對照組(P<0.05)；對照組術(shù)后1、3、7 d 熱縮足反射潛伏期均高于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 3組大鼠機械縮足反射潛伏期比較術(shù)前，3組大鼠機械縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。右美托咪定組術(shù)后1、3、7 d機械縮足反射潛伏期均高于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)，低于對照組(P<0.05)；病理性神經(jīng)痛模型組術(shù)后1、3、7 d機械縮足反射潛伏期均低于對照組(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表1 3組大鼠熱縮足反射潛伏期比較(s， ±s)

注：與對照組相比，aP<0.05； 與病理性神經(jīng)痛模型組相比，bP<0.05。

表2 3組大鼠機械縮足反射潛伏期比較(s， ±s)

注：與對照組相比，aP<0.05； 與病理性神經(jīng)痛模型組相比，bP<0.05。

2.4 3組大鼠免疫組化結(jié)果比較術(shù)后14 d，對大鼠組織進行免疫組化分析，對照組P38MAPK平均光密度為(0.015±0.03)，模型組為(0.163±0.39)，右美托咪定組為(0.078±0.043)；病理性神經(jīng)痛模型組與右美托咪定組P38MAPK平均光密度明顯高于對照組(P<0.05)，而右美托咪定組明顯低于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)，結(jié)果見圖1～3。

圖1 對照組大鼠免疫組化圖(×200)

圖2 病理性神經(jīng)痛模型組免疫組化圖(×200)

圖3 右美托咪定組免疫組化圖(×200)

2.5 3組大鼠RT-PCR結(jié)果比較右美托咪定組與病理性神經(jīng)痛模型組、對照組術(shù)后1 d P38MAPK mRNA水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；右美托咪定組術(shù)后7、14 d P38MAPK mRNA水平低于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)，高于對照組(P<0.05)；對照組術(shù)后7、14 d P38MAPK mRNA水平低于病理性神經(jīng)痛模型組(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠P38MAPK mRNA水平結(jié)果比較(±s)

注： 與對照組相比，aP<0.05； 與病理性神經(jīng)痛模型組相比,bP<0.05。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛較為常見，是一種由神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性疾病或者由受損直接引起的慢性疼痛，這種疼痛常表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺異常、痛覺過敏等，目前尚無有效治療方法[10]。為深入探究病理性神經(jīng)痛的發(fā)生機制，本研究制作了病理性神經(jīng)痛大鼠模型，該模型操作較為簡單，成功率高，由于僅對坐骨神經(jīng)干進行結(jié)扎，因而對大鼠損傷較小[11]。本研究中所有大鼠造模成功，實驗結(jié)果表明，術(shù)后病理性神經(jīng)痛模型組與右美托咪定組大鼠的疼痛表現(xiàn)(損傷同側(cè)腳趾并攏或內(nèi)收，伴隨或不伴隨自發(fā)性甩腿、舔足、踮地行走等)均有所減少，說明經(jīng)右美托咪定治療后，大鼠疼痛有所緩解。本實驗結(jié)果表明，右美托咪定組術(shù)后1、3、7 d 熱縮足反射潛伏期均高于病理性神經(jīng)痛模型組,低于對照組,說明經(jīng)右美托咪定治療有效減輕了大鼠術(shù)后造模側(cè)的熱痛敏。右美托咪定組術(shù)后1、3、7 d 機械縮足反射潛伏期均高于病理性神經(jīng)痛模型組，低于對照組,說明經(jīng)右美托咪定治療有效減輕了大鼠術(shù)后造模機械痛敏。

在病理性疼痛的發(fā)病過程當中 ,多種激酶通路匯聚到P38MAPK, P38MAPK在神經(jīng)元可塑改變環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用[12]。在背根神經(jīng)節(jié)以及脊髓背角神經(jīng)元感受誘發(fā)的可塑性維持當中，P38MAPK信號通路激活有重要影響，一方面會加大基因轉(zhuǎn)錄,另一方面會誘發(fā)靶蛋白后調(diào)制[13]。有研究表明，使用右美托咪定不僅對患者呼吸系統(tǒng)的自主呼吸功能的影響較小，其血流動力學波動范圍可控，同時亦能減少患者心肌的耗氧量[14-15]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后14 d病理性神經(jīng)痛模型組與右美托咪定組大鼠P38MAPK平均光密度明顯高于對照組，而右美托咪定組明顯低于模型組;術(shù)后7、14 d,右美托咪定組P38MAPK mRNA水平低于病理性神經(jīng)痛模型組，高于對照組,提示右美托咪定對病理性神經(jīng)痛坐骨神經(jīng)卡壓性模型大鼠鎮(zhèn)痛作用是通過P38MARK信號通路發(fā)揮作用，這與Reade等[16]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，對病理性神經(jīng)痛大鼠進行鞘內(nèi)注射右美托咪定可提高大鼠熱縮足反射潛伏期和機械足反射潛伏期，疼痛緩解作用的發(fā)揮可能是通過下調(diào)P38MAPK mRNA水平表達，從而抑制P38MAPK活化實現(xiàn)的。