少弱精子癥患者精子候選差異蛋白Cu-Zn SOD和GSS的驗(yàn)證及其表達(dá)研究

蔣丹丹， 斯依提·阿木提， 張盼盼， 努爾比亞·阿力甫， 白生賓， 阿地力江·伊明

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

精子的質(zhì)量、數(shù)量及形態(tài)學(xué)改變是影響受精的重要因素，而其中精子蛋白質(zhì)功能改變是影響上述因素的關(guān)鍵點(diǎn)[1]。但由于精子的成熟、獲能及受精等過程中涉及的蛋白質(zhì)非常復(fù)雜，且種類繁多，給研究帶來一定困難。故本研究收集臨床少弱精子癥患者精液并分離精子后，采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)技術(shù)對(duì)少弱精子癥差異蛋白進(jìn)行篩查，并在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選取銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)和谷胱甘肽合成酶(GSS)，在少弱精子癥患者精子中進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)檢測(cè)其在少精子癥、弱精子癥患者中的表達(dá)，探討Cu-Zn SOD和GSS在少精、弱精及少弱精子癥中的生殖生物學(xué)意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2017年7月-2018年4月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性，受試者采用手淫法將精液收集到無菌容器中，立即送檢，置于37℃恒溫水浴箱中，液化后按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第五版)[2]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，排除患有生殖道感染、性傳播疾病、輸精管堵塞、腫瘤、外傷手術(shù)及糖尿病等疾病的男性精液，收集符合少精子癥(O組)、弱精子癥(A組)、少弱精子癥(OA組)和正常組(N組)診斷標(biāo)準(zhǔn)的精液標(biāo)本，患者數(shù)量依次為105例、150例、50例和106例，經(jīng)過離心后得到精子，制備精子涂片、提取精子蛋白備用。

1.2 主要儀器與試劑WLJY-9000型彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(北京偉力公司)，DYY-8C電泳儀(方正公司)，F(xiàn)E 0723凝膠成像儀(Santa Clara 公司)，Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡(尼康公司)，兔抗人抗體Cu-Zn SOD、GSS(Proteintech公司)，細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)，BCA蛋白定量試劑盒(聚合美生物科技有限公司)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美生物科技公司)，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技術(shù)公司)，DAPI染色液(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TMT技術(shù)篩選少弱精子癥差異表達(dá)蛋白 人精子樣品加入RIPA裂解液后，通過bradford法定量蛋白，并取每個(gè)樣品100 μg蛋白體積，加入胰蛋白酶，37℃水浴24 h后使用TMT標(biāo)記試劑盒對(duì)酶解得到的肽段進(jìn)行同位素標(biāo)記。使用強(qiáng)陽離子交換色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行HPLC預(yù)分離。使用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測(cè)16個(gè)預(yù)分離的組分，并用PD(Proteome Discoverer 1.4，thermo)軟件定量分析，選取P<0.05，差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833的蛋白為差異蛋白。

1.3.2 免疫熒光 精子涂片經(jīng)甲醇固定10 min，自然風(fēng)干后PBS洗3次→5% BSA封閉30 min→兔抗人Cu-Zn SOD(1∶50)、GSS(1∶50)抗體濕盒內(nèi)4℃孵育過夜→PBS洗6次→Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)37℃孵育2.5 h→PBS洗6次→DAPI染核10 min→PBS洗3次→封片后熒光顯微鏡下2 h內(nèi)觀察并采集圖像。

1.3.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot) 4組精子經(jīng)裂解液提取蛋白，測(cè)定濃度，后與5×上樣緩沖液混合沸水煮10 min。根據(jù)目的蛋白的分子量，配置分離膠及濃縮膠，并且上樣開始電泳，80 V，30 min后，將電壓改為120 V，持續(xù)90 min。用甲醇激活的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2 h，5 %脫脂牛奶封閉2 h，根據(jù)目的蛋白條帶大小切膜后用兔抗人Cu-Zn SOD(1∶300)、GSS(1∶300)將抗體在4℃孵育過夜，第二天取出膜后TBST洗3次，二抗(1∶6 000)在室溫下孵育2 h，TBST洗3次，ECL檢測(cè)試劑盒A液和B液按1∶1混勻后滴入PVDF膜，并用凝膠成像儀觀察。

2 結(jié)果

2.1 TMT技術(shù)篩選少弱精子癥差異蛋白Cu-Zn SOD和GSS結(jié)果以差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833為標(biāo)準(zhǔn)，差異蛋白Cu-Zn SOD和GSS均為下調(diào)蛋白。在少弱精子癥差異蛋白結(jié)果中，Cu-Zn SOD為下調(diào)差異蛋白(為N組的0.77倍)，GSS為下調(diào)差異蛋白(為N組的0.82倍)，見表1。

表1 Cu-Zn SOD和GSS在少弱精子癥差異蛋白的結(jié)果

2.2 精子中Cu-Zn SOD表達(dá)的驗(yàn)證熒光顯微鏡下，免疫熒光結(jié)果顯示，Cu-Zn SOD(紅色熒光)定位在人精子尾部中段和主段。與N組比較，Cu-Zn SOD蛋白在O組、A組和OA組精子的尾部中段和主段熒光強(qiáng)度明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western-bolt實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，O組、A組和OA組精子Cu-Zn SOD蛋白的表達(dá)明顯低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。

N

O

A

OA

Cu-Zn SOD DAPI Merge

2.3 精子中GSS表達(dá)的驗(yàn)證熒光顯微鏡下，免疫熒光結(jié)果顯示，GSS(紅色熒光)定位在人精子尾部中段和主段。與N組比較，GSS蛋白在OA組精子的尾部中段和主段熒光強(qiáng)度明顯減弱或缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western-bolt結(jié)果顯示，OA組精子GSS蛋白表達(dá)明顯低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

表2 免疫熒光檢測(cè)4組人精子中Cu-Zn SOD和GSS蛋白的表達(dá)

注：與N組比較，*P<0.05。

N

O

A

OA

GSS DAPI Merge

3 討論

根據(jù)WHO資料顯示，育齡夫婦中受到不育不孕困擾的約占20%，其中男性因素占40%～60%[3]。而少弱精子癥是男性不育的主要原因之一，少弱精子癥占男性不育的46%[4]。由于少弱精子癥的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，雖治療方法包括西醫(yī)和中醫(yī)，但總體治療效果差，逐漸成為影響男性生殖健康的重要因素[5]。

氧化應(yīng)激發(fā)生在活性氧(ROS)顯著升高并超過人體正常的抗氧化防御時(shí)。生理水平的ROS在精子獲能中必不可少，并可影響精子運(yùn)動(dòng)、DNA完整性及精卵結(jié)合能力[6]。但ROS的升高可致精子質(zhì)量下降，包括精子數(shù)量的減少及活力的減低[7]。研究表明，在不育男性中ROS可以升高40%～80%[8]。精子易受ROS的損傷，故抗氧化劑的存在可以保護(hù)精子免受損傷。精子和精漿中均含有豐富的抗氧化劑，如SOD、谷胱甘肽(GSH)、硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶(Trx/TrxR)系統(tǒng)等。

GSH具有多種重要的生理功能，特別是對(duì)維持體內(nèi)的氧化還原環(huán)境。在人精子中，GSH還與Trx/TrxR系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)抗氧化蛋白，而抗氧化蛋白可以將超氧化物、過氧化氫等轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，從而清除ROS，避免精子損傷[13]。并且研究表明，GSH對(duì)精子癥發(fā)生的早期及精卵結(jié)合的早期反應(yīng)都起著關(guān)鍵的作用[14]。GSH是在GSS的催化下生成的，并且GSS的表達(dá)水平可直接影響GSH的含量[15]，GSS含量的減少可干擾GSH生成，但目前的研究尚未闡明GSS在精子內(nèi)的影響。在本次研究中，GSS在少弱精子癥中含量減少，這與TMT篩查的結(jié)果一致，在少精子癥和弱精子癥中雖下調(diào)表達(dá)，但不顯著，對(duì)于其在這兩種疾病精子中的影響有待進(jìn)一步研究。在少弱精子癥的精子中，由于GSS含量的減低，GSH合成減少，抗氧化作用減弱，此時(shí)精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

蛋白質(zhì)組學(xué)可從整體的角度分析少弱精子癥精子的差異蛋白，而本研究根據(jù)差異蛋白的結(jié)果，又考慮到氧化應(yīng)激是少弱精子癥的重要發(fā)病機(jī)制之一，故選取Cu-Zn SOD和GSS進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)Cu-Zn SOD、GSS可做為少弱精子癥的潛在候選標(biāo)志物，并可為臨床上少弱精子癥的篩查和治療提供可能靶點(diǎn)。