大豆11S球蛋白水解肽的制備及抗氧化研究

馬福建，高長城，解迪，劉亞男，鄒險峰

（長春大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130022）

豆粕是大豆提取豆油后的副產品，蛋白質含量高達45%以上[1]，主要的蛋白質是沉降系數(shù)為7S 與11S的球蛋白，其中大豆11S 球蛋白含量占大豆蛋白總含量的40%以上，對大豆蛋白的功能特性有著重要影響[2]。大豆11S 球蛋白既可作為食品的組分，又可作為添加劑，具有比7S 球蛋白較好的膠凝特性，能提高和改善原有食品的質構特性及口感。大豆11S 球蛋白分子是由6個酸性亞基和6個堿性亞基構成的兩個環(huán)狀六角形結構，亞基之間通過二硫鍵結合。但由于11S 球蛋白具有緊密的分子結構，多數(shù)活性基團被包裹在球狀結構的內部，很難表現(xiàn)其生理活性[3]。大豆11S 球蛋白經(jīng)酶水解成大豆肽后，其氨基酸組成幾乎沒有變化，但由于肽鏈變短，在酸性條件下溶解度顯著提高[4-6]。并且水解的同時，隱藏在蛋白質分子內部具有生物活性的氨基酸殘基被釋放出來，表現(xiàn)出如抗氧化活性、抗疲勞作用、促進礦物吸收、抑制膽固醇、免疫調節(jié)、抗高血壓、促進脂肪代謝等活性[7-10]。有些活性肽甚至同時具備兩種以上的功能，對人體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和免疫調節(jié)系統(tǒng)有很強的調節(jié)作用[11]。

大豆蛋白水解物最重要的生理活性之一是其抗氧化活性，可以清除自由基，螯合金屬離子，并防止脂質過氧化。目前，有關大豆抗氧化活性肽的研究很多，大多是以大豆分離蛋白為原料進行酶水解制備抗氧化活性肽，但關于11S 蛋白組分酶解物抗氧化活性的研究分析比較少[12]。研究表明，人體腸道對11S 水解肽的吸收顯著高于對11S 球蛋白或氨基酸的吸收[13]。11S蛋白經(jīng)蛋白酶解之后抗氧化活性顯著提高[14]。胰蛋白酶是特異性內切酶，與人體消化系統(tǒng)內酶相似，故水解產物可能更適于人體吸收，用胰蛋白酶對11S 球蛋白進行改性，能改善其某些功能特性[15]。

本研究以大豆11S 球蛋白為底物，水解度為指標，探討大豆11S 球蛋白的胰蛋白酶水解條件，并研究大豆肽溶液對超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH）的清除率，為酶解制備大豆肽以及篩選抗氧化活性較好的大豆肽提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豆粕：佳木斯冬梅大豆食品有限公司；胰蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；三氯乙酸、HCl、NaOH 等：北京化工廠。

FDU-2100 型冷凍干燥儀：日本EYELA 公司；LXJ-IIB 型離心機：上海安亭儀器廠；pHS－2 型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；UV-1280 型紫外-可見分光光度儀：日本島津公司；KDN-103F 型凱氏定氮儀、HYP-320 型消化爐：上海纖維儀器有限公司；HH-ZK1 型恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆11S 球蛋白的分離

大豆11S 球蛋白的分離參照Nagano 法[16]，具體流程如下：

豆粕→加水混合，料液比1/10（g/mL）→調節(jié)pH7.5→提取 1 h→離心分離 10 000×g，15 min→取上清液→添加亞硫酸鈉0.98 g/L→調節(jié)pH6.4→4℃過夜→離心分離10 000×g，15 min→沉淀→凍干→大豆11S 蛋白粗提物

1.2.2 酶解工藝流程和酶解條件優(yōu)化

大豆11S 球蛋白溶液（2 mg/mL）→95℃水浴10 min→調節(jié)pH 值→加胰蛋白酶水解→沸水浴10 min滅活→加三氯乙酸→離心→取上清液→抗氧化性檢測

1.2.2.1 單因素試驗

以水解度為指標在底物濃度為2 mg/mL 的條件下考察酶與底物比、pH 值、水解溫度和水解時間對酶水解大豆11S 球蛋白水解度的影響。

1.2.2.2 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，以水解度為響應值，采用Box-Behnken 試驗設計方案進一步優(yōu)化試驗結果。

1.2.3 水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

水解度測定采用三氯乙酸法（trichloroacetic acid，TCA）[17]，具體步驟如下：

準確量取10 mL 酶解液，加入10 mL10%的三氯乙酸溶液，震蕩10 min，5 000×g 離心10 min，取上清液，采用凱氏定氮法進行測定。

式中：N2為大豆11S 球蛋白酶解上清液中加10%TCA 后的可溶性氮，mg；N1為水解前大豆 11S 球蛋白上清液中加10% TCA 后的可溶性氮，mg；N0為大豆11S 球蛋白中含氮量，mg。

1.2.4 抗氧化性測定

大豆11S 球蛋白水解肽的超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定采用鄰苯三酚法[18]。大豆11S 球蛋白水解肽的羥自由基（·OH）清除率的測定采用羅丹明B-Feton 體系光度法[19]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶與底物比對水解的影響

選取底物濃度2 mg/mL，pH 值為8.0，溫度50℃，水解時間 3 h。研究 1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g 的酶底比對水解度的影響，結果見圖1。

圖1 酶與底物比對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由于反應體系酶用量較少，本試驗將胰蛋白酶配制成一定濃度的酶液，加入反應體系。由圖1可知，在一定底物濃度下，水解度隨酶與底物比的增加而呈上升趨勢，當酶與底物比達到6 000 U/g 時，水解度最大，繼續(xù)增加酶與底物比，水解度基本不發(fā)生改變。這是由于酶與底物已達到飽和，水解因而不再增加。因此，本試驗中酶水解大豆11S 球蛋白的最佳酶底比是6 000 U/g。

2.1.2 pH 值對水解的影響

底物濃度2 mg/mL，酶與底物比為6 000 U/g，溫度50℃，水解時間 3 h，pH 值為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 時對水解度的影響，結果見圖2。

圖2 pH 值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on hydrolysis degree

由圖2可知，在pH 值為8 時，水解度達到最大值。這是因為酶分子上活性基團只有在一定的解離狀態(tài)，才最適于與底物結合，pH 值高于或低于最適pH值時，活性基團的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結合力降低，因而酶反應速率降低。因此，本試驗中胰蛋白酶水解大豆11S 球蛋白的最佳酶解pH 值為8。

2.1.3 溫度對水解的影響

底物濃度2 mg/mL，酶與底物比為6 000 U/g，pH 值為 8.0，水解時間 3 h，研究溫度為 30、40、50、60、70℃時對水解度的影響，結果見圖3。

圖3 水解溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis degree

由圖3可知，大豆11S 球蛋白的水解度隨著水解溫度的升高逐漸增大，當溫度為50℃時水解度最大，繼續(xù)升溫，水解度反而呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于隨著水解溫度的升高，反應體系中底物與酶分子運動速度加劇，增大了有效碰撞的幾率，分子熱運動的動能增大，與活化能的能壘差減小，反應速度加快，但隨著溫度的進一步升高而使酶逐步變性，即通過酶活力的減少而降低酶的反應速度。因此，本試驗中胰蛋白酶水解大豆11S 球蛋白的最適溫度為50℃。

2.1.4 水解時間對水解的影響

底物濃度2 mg/mL，酶與底物比為6 000 U/g，pH值為 8.0，溫度 50℃，以水解度為指標研究 1、2、3、4、5 h的水解時間對水解度的影響，結果見圖4。

由圖4可知，大豆11S 球蛋白的水解度隨著酶解時間的增加而逐漸增大，反應時間在3 h 之后，水解趨于穩(wěn)定，水解度增加不明顯。這是由于隨著反應的進行，胰蛋白酶的作用位點逐漸變少，水解度變化不大。因此，本試驗中胰蛋白酶水解大豆11S 球蛋白的最適反應時間為3 h。

2.2 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，以水解度為響應值，選取酶與底物比、pH 值、溫度、時間為影響因素，設計了四因素三水平的響應面分析試驗，其中試驗因素與水平的選取見表1，試驗結果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

表1 響應面分析的因素和水平取值表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 試驗設計結果Table 2 Test design results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance

采用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)行分析得到的編碼因子的回歸方程為：Y=87.11+1.31X1+2.25X2-3.07X3-1.65X4+0.14X1X2-0.48X1X3-0.083X1X4-0.91X2X3+2.47X2X4+2.78X3X4-1.98X12-3.33X22-3.64X32-3.36X42

由方差分析可知，回歸方程極顯著，失擬性不顯著，回歸系數(shù)R2=0.932 1，說明模型擬合試驗結果擬合度良好，試驗值與預測值相關性很高，可用該模型對試驗結果進行分析和預測[20]。由結果分析，該模型的一次項 X1、X2、X4顯著，X3極顯著；二次項 X22、X32、X42極顯著，X12顯著；交互項 X2X4、X3X4顯著。由表 3可知對大豆11S 球蛋白水解度的影響因素大小順序為：溫度〉pH 值〉水解時間〉酶與底物比。

2.3 驗證試驗

通過對模型回歸方程的優(yōu)化求解，得到最佳水解條件為：酶與底物比 4 851.73 U/g、pH8.14、溫度 43.58℃、時間2.59 h，此條件下理論預測最大水解度為89.03%。由于實際情況，取水解條件為：酶與底物比4 900 U/g、pH8.1、溫度44℃、水解時間2.6 h 進行3 次驗證試驗取平均值得到水解度為89.25%，與預測值基本一致。

2.4 大豆肽的超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率測定

不同濃度的大豆肽溶液對O2-·的清除效果如圖5所示。

圖5 大豆肽對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of soybean peptides on superoxide anion free radicals

由圖5可知，隨著大豆肽溶液濃度的升高，對O2-·的清除率也隨之增加，呈正相關關系，并且清除率隨著肽液達到一定濃度之后變化不大，當肽液濃度為12 mg/mL 時清除率最高，達到46.86 %。說明大豆肽溶液具有較強的清除O2-·能力，表現(xiàn)為較好的抗氧化活性。

2.5 大豆肽的羥自由基（·OH）的清除率測定

不同濃度的大豆肽溶液對·OH 的清除效果如圖6所示。

圖6 大豆肽對羥基自由基的清除效果Fig.6 Scavenging effect of soybean peptide on hydroxyl radicals

由圖6可知，隨著大豆肽溶液濃度的升高，對·OH的清除率也隨之增加，當濃度達到0.5 mg/mL 時對·OH的清除率最高，清除率最高可達33.73%。

蛋白質具有復雜的分子結構，多肽鏈彎曲折疊，表面包裹著親水性外殼，具有抗氧化能力的氨基酸殘基被折疊和壓縮隱藏在大豆11S 球蛋白分子內部，當胰蛋白酶水解大豆11S 球蛋白后抗氧化活性的氨基酸殘基暴露，表現(xiàn)出抗氧化能力增強。

3 結論

大豆11S 球蛋白中存在多個胰蛋白酶的專一性切割位點，本研究通過胰蛋白酶專一識別賴氨酸和精氨酸殘基的肽鏈，獲得多肽溶液，并研究對超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）的清除效果。以水解度為指標考察，在底物濃度為2 mg/mL 時，酶與底物比、pH 值、溫度和水解時間對胰蛋白酶水解大豆11S球蛋白單因素影響，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法研究了胰蛋白酶水解大豆11S 球蛋白的水解條件：當酶和底物比 4 900 U/g、pH 值 8.1、溫度 44℃、水解時間2.6 h，大豆11S 球蛋白水解度為89.25%。通過對其抗氧化能力的測定表明，大豆肽溶液具有良好的O2-·和·OH 的清除能力，清除率隨著大豆肽添加量的增加而提高。當肽液濃度為12 mg/mL 時，對O2-·的清除率最高達到46.86%；當肽液濃度為0.5 mg/mL 時對·OH 的清除率最高，達到33.73%。