茶葉膳食纖維作為益生元對腸道菌群的影響

王津，茹鑫，鄒妍，趙路漫，馬慧，王碩，*

（1.南開大學 醫(yī)學院 天津市食品科學與健康重點實驗室，天津 300350；2.上海康識食品科技有限公司，上海 201103）

茶葉是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公布的六大健康飲料之首，受到各國人民的喜愛。茶葉中含有700 多種已知化合物，包括茶多酚（25 %～35 %）、茶多糖（20 %～25 %）、蛋白質(zhì)（25 %～30%）以及26種氨基酸、50 余種礦質(zhì)元素和維生素等多種功能性成分[1]。然而人們很少注意茶葉膳食纖維。目前，膳食纖維在歐美等國受到普遍關注，被譽為人類第七大營養(yǎng)素[2]，并將其廣泛應用于食品及保健品生產(chǎn)中，但是有關茶葉膳食纖維的研究開展較少[3]。傳統(tǒng)的泡茶方式以及茶飲料加工剩余的廢棄物，使剩余的茶膳食纖維未得到充分利用，對茶膳食纖維的開發(fā)利用問題日益引起人們的關注。如果能科學的制取茶葉中的膳食纖維，將茶膳食纖維應用到食品加工領域，如餅干、面包、蛋糕、糖果、點心和其他飲品中，可以在不影響風味口感的同時，賦予食品更多保健的功能，具有經(jīng)濟、社會和健康等多方面的效益[4]。

美國谷物化學學會將膳食纖維定義為“在人的小腸中不被消化吸收而在大腸中可以全部或部分發(fā)酵的植物可食部分或碳水化合物類似物”[5]。茶葉膳食纖維主要存在于茶葉的細胞壁、細胞液和細胞間質(zhì)中，主要由纖維素、半纖維素、樹膠、木質(zhì)素和原果膠等碳水化合物類似物組成[6]。茶葉可溶性膳食纖維主要包括樹膠、果膠、原果膠等物質(zhì)，吸水膨脹后形成凝膠體，具有黏滯性，可增加茶湯的醇厚度，使口感順滑、回甘、韻味悠長。與其他食品性輔料混配后能在小腸黏膜表面形成一層“隔離層”，具有多重保健功效。茶葉中的水不溶性膳食纖維主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是茶鮮葉細胞壁的重要組成[7]。茶葉中的水不溶性膳食纖維是茶樹細胞壁的組成組分，是支撐茶樹正常生長發(fā)育的重要生理物質(zhì)。

近年來，人們越來越關注腸道微生物，因為它對宿主的健康起到重要作用。已經(jīng)報道的腸道微生物與宿主生理、營養(yǎng)、代謝和免疫功能息息相關[8]。茶葉中的膳食纖維能起到改善人體腸道功能的作用。它可被大腸中的有益菌發(fā)酵，從而產(chǎn)生大量乳酸等化學成分，調(diào)節(jié)人體腸道內(nèi)的酸堿度，有益于體內(nèi)消化系統(tǒng)，并能在一定程度上改善腸道菌群失調(diào)[9]。人體腸道中，腸道微生物利用膳食纖維產(chǎn)生的最重要的代謝產(chǎn)物是短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）[10]。SCFAs的重要作用表現(xiàn)為：影響腸上皮細胞轉(zhuǎn)運，促進腸細胞的代謝、生長和分化，為腸粘膜上皮細胞提供能量，影響肝脂質(zhì)與碳水化合物調(diào)控等[11]。

本試驗以茶膳食纖維作為原材料，研究了茶膳食纖維的持水力、持油力、膨脹力等理化性質(zhì)；同時使用傅里葉紅外吸收光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、X-射線衍射對茶膳食纖維的官能團組成、微觀結(jié)構和結(jié)晶度進行研究。通過這些表征手段分析茶膳食纖維微觀結(jié)構。從體外探討茶膳食纖維對腸道菌群生長的作用效果，為其在保健食品中的應用提供參考依據(jù)。通過模擬腸道厭氧環(huán)境，建立小鼠腸道菌群體外模型，探究不同含量茶膳食纖維對小鼠腸道菌群的影響。選擇雙歧桿菌和乳桿菌為腸道益生菌的代表，腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌為腸道有害菌的代表進行檢測。本研究對于闡明茶膳食纖維與腸道菌群的關系以及開發(fā)茶膳食纖維功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉膳食纖維粉由綠茶茶葉經(jīng)烘干粉碎得到[12]；MRS 培養(yǎng)基（乳酸菌）、BBL 培養(yǎng)基（雙歧桿菌）、伊紅美藍培養(yǎng)基（腸桿菌）、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷培養(yǎng)基（腸球菌）、TSC 培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌）和改良GAM 培養(yǎng)基（擬桿菌）：北京奧博星生物技術有限公司；乙酸、丙酸、丁酸和乳酸（分析純）：天津渤化化學試劑有限公司。

1.2 儀器

JSM-IT300LV 掃描電子顯微鏡：日本電子公司；TENSOR27 傅里葉紅外吸收光譜、D8-ADVANCE X 射線衍射：德國布魯克公司；7890B-7200 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶葉膳食纖維基本成分檢測

茶膳食纖維的水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪和總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維測定參考文獻[13]；茶多酚：采用GB/T 31740.2-2015《茶葉中茶多酚的測定》的方法測定。纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的含量測定參考文獻[14]。

1.3.2 茶葉膳食纖維的理化性質(zhì)

1.3.2.1 持水力測定

準確稱取恒重后茶膳食纖維樣品0.5 g 于15 mL 離心管中，向其中加入10 mL 蒸餾水，充分攪拌使樣品均勻分散于離心管中，密封后室溫下靜置過夜，4 000 r/min條件下離心25 min，棄去上清液，并用濾紙吸干管壁殘留水分，稱量濕重質(zhì)量[15]。持水力計算公式如下：

公式中：m0為樣品干重，g；m1為離心管質(zhì)量，g；m2為吸水后樣品和離心管質(zhì)量，g。

1.3.2.2 膨脹力測定

準確稱取干燥至恒重的茶膳食纖維樣品0.25 g 于10 mL 試管中，測得干樣體積，并向其中加入蒸餾水5 mL，充分攪拌以除去溶液中的氣泡，25℃條件下靜置過夜，準確讀取膨脹后的體積數(shù)[16]。膨脹力計算公式如下：

公式中：V2為樣品膨脹后的測定體積，mL；V1為樣品干樣的測定體積，mL；m 為樣品干重，g。

1.3.2.3 持油力測定

準確稱取0.5 g 茶膳食纖維樣品于50 mL 離心中，加入植物油10 mL，振蕩搖勻，室溫下放置1 h，5 000 g離心20 min，小心除去上清液，稱重后計算持油力：

公式中：m0為樣品干重，g；m1為離心管質(zhì)量，g；m2為吸油后樣品和離心管質(zhì)量，g。

1.3.3 茶葉膳食纖維的結(jié)構表征

1.3.3.1 掃描電鏡分析

將茶膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維3個樣品干燥至恒重，取適量放入樣品臺，采用離子濺射方法將其表面鍍金，在加速電壓10 kV 條件下對已制備好的樣品進行掃描電鏡觀察。

1.3.3.2 傅里葉紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀對茶膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維3個樣品的官能團和糖苷鍵進行檢測。紅外光譜測定首先將待測的樣品和溴化鉀（分析純）置于烘箱內(nèi)干燥（100℃，48 h），放入干燥器中保存。準確稱取樣品各2 mg 于瑪瑙研缽中，將研磨好的混合粉末置于電動粉末壓片機中，制成直徑10 mm，厚度0.5 mm 的透明薄片，立即進行紅外光譜掃描，掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1，所得紅外光譜利用OMNIC 8.0 軟件（美國尼高力公司）進行處理。

1.3.3.3 X 射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）

利用X 射線衍射儀在電壓為40 kV，電流為40 mA，射線源為Cu-Kα 源，波長為0.154 nm 的條件下掃描已制備好的茶膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維3個樣品，掃描速率為2°/min，掃描范圍 4 °～70 °（2θ），步長 0.02 °。利用 Jade 5.0 軟件（美國材料數(shù)據(jù)公司）對所得數(shù)據(jù)進行分析處理。

1.3.4 茶葉膳食纖維體外模擬大腸發(fā)酵過程

無菌發(fā)酵瓶中加入基礎培養(yǎng)基，并在厭氧工作站中37℃預還原過夜。每升基礎培養(yǎng)基中含有：2 g 蛋白胨，2 g 酵母膏，0.1 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·6H2O，2 g NaHCO3，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g 膽鹽，10 mL 維生素 K1，2 mL吐溫80 和1 mL 氯高鐵血紅素溶液，0.2 g 葡萄糖，以上成分溶解后調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基pH 值至7.0，加入4 mL 0.025%刃天青溶液并滅菌。

采用逼迫法無菌收集小鼠糞便，取樣當天換無菌墊料，減少外界微生物對樣品的污染。將每只小鼠糞便分別放入滅菌EP 管，立即用預還原的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，0.1 mol/L，pH7.0）按照體積比1∶9 稀釋。取10 mL 糞便稀釋液（1%糞便接種量）加入預還原基礎培養(yǎng)基中，樣品分為對照組、茶膳食纖維（低、中、高3個劑量水平分別為1 %、2 %和3 %茶粉樣品）組。將樣品加入混勻后在37℃厭氧工作站中發(fā)酵，并在發(fā)酵的第0、6、12、24 小時取樣檢測腸道菌群數(shù)量、pH 值。計數(shù)采用平板計數(shù)法，10 倍梯度稀釋法稀釋，稀釋液為pH 7.0，0.1 mol/L PBS，選取適當梯度稀釋液100 μL 均勻涂布于不同選擇培養(yǎng)基上（腸桿菌、腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和擬桿菌）。

短鏈脂肪酸的測定使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，方法如下，取2 mL 發(fā)酵液置于10 mL 離心管中，加0.5 mol/L H2SO450 μL，用 2.0 mL 的乙醚萃取 30 s，然后 10 000 g 離心 5 min，上清液過 0.45μm 的膜，取 1 mL上清液加入裝有0.25 g 含無水硫酸鈉的離心管中除去殘留水分，移取上清液用于氣相測定。SCFAs 測定采用外標法，用乙酸、丙酸、丁酸作標準曲線。采用Rtx-Wax毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），使用氦（〉 99.999%）作為載氣，以1 mL/min 的恒定流速通過柱。分流比為 10∶1，進樣量為 1 μL，進樣溫度為 240℃程序升溫。程序升溫設置：初溫100℃，以10℃/min 升溫至140℃，保持1 min；然后60℃/min 程序升溫至200℃保持3 min，離子化溫度為230℃，質(zhì)量掃描為選掃描模式。

pH 值的測定，將發(fā)酵液9 000 r/min 下離心10 min，取其上清液裝入離心管中，pH 計測定發(fā)酵上清液的pH 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉膳食纖維基本成分和理化特性

茶葉膳食纖維基本成分和理化性質(zhì)見表1。

由表1可見，茶葉膳食纖維粉總膳食纖維含量占（61.15±1.24）%，其中不可溶性膳食纖維高達（54.62±1.10）%，而可溶性膳食纖維占（6.53±0.19）%。有研究表明，可溶性與不可溶性膳食纖維的比例是衡量膳食纖維功能特性的重要指標[17]。本研究茶葉膳食纖維粉可溶性膳食纖維與不可溶性膳食纖維構成比例大約為質(zhì)量比1∶8，其中可溶性膳食纖維含量略少。茶葉膳食纖維中主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠，還含有一定蛋白質(zhì)、茶多酚和少量脂肪。

表1 茶葉膳食纖維基本成分和理化性質(zhì)Table 1 Basic components and physicochemical properties of tea dietary fiber

由表1可見，茶葉膳食纖維粉具有較高的持水力、持油力和膨脹力。持水力、持油力和膨脹力是影響膳食纖維生理功能發(fā)揮的重要因素。持水力高、膨脹力大的膳食纖維在腸胃中更容易吸水膨脹形成大體積、高黏度的溶膠或凝膠，產(chǎn)生飽腹感而抑制進食量，也有利于刺激腸道蠕動，從而達到減肥、通便等作用。進食持油力高的膳食纖維，可直接抑制高脂血癥、預防動脈粥樣硬化，對預防心腦血管疾病也有重要作用。

2.2 茶葉膳食纖維掃描電鏡結(jié)果

圖1為茶葉膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維樣品的掃描電鏡圖。由圖1a可以看出，茶葉膳食纖維粉不規(guī)則的團狀，表面凹凸不平，有少量顆粒狀物質(zhì)存在。由圖1b可以看出，不可溶性膳食纖維結(jié)構疏松，空隙較大，略有褶皺。由圖1c可以看出，可溶性膳食纖維結(jié)構較為致密，呈片狀結(jié)構且表面無其他顆粒附著。

圖1 茶葉膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopeof tea dietary fiber powder，insoluble dietary fiber and soluble dietary fiber

2.3 茶葉膳食纖維紅外光譜分析結(jié)果

物質(zhì)紅外光譜吸收峰的位移和吸收強度與其化學組成和化學鍵類型密切相關見圖2。

圖2 茶葉膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維傅里葉紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy of tea dietary fiber powder，insoluble dietary fiber and soluble dietary fiber

由圖2可知，可溶性膳食纖維中3 500 cm-1處附近出現(xiàn)游離態(tài)O-H 的伸縮振動峰，而茶葉膳食纖維原粉和不可溶性膳食纖維中，在3 300 cm-1處附近是締合態(tài) O-H 的伸縮振動峰。2 922 cm-1～2 926 cm-1附近處為糖類甲基和亞甲基C-H 的伸縮振動峰，且在3個樣品中均出現(xiàn)了此位置的峰。1 754 cm-1處為C=O吸收，說明可能存在酮、醛或酸存在。在1 649 cm-1和1 619 cm-1附近代表有蛋白酰胺1 氮和酰胺2 氮的伸縮振動。1 200 cm-1～1 400 cm-1是 C-H 的變角振動，在這些區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰。在茶粉和不可溶膳食纖維圖中，1 300 cm-1～1 000 cm-1區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的多個小尖峰組成的強寬峰，是C-O-C 的收縮振動峰。茶葉膳食纖維粉中具有C=O 鍵、O-H 鍵、C-H鍵等纖維素及半纖維素的特征吸收峰。1 148 cm-1和1 036 cm-1為OH 多糖吸收峰。1 634 cm-1處是木質(zhì)素中苯環(huán)的特征吸收峰。

2.4 茶葉膳食纖維X射線衍射分析結(jié)果

X 射線衍射法測量的是長程序列，可以測量樣品的晶體組成及晶型。纖維素類物質(zhì)是由70%有序結(jié)晶纖維素區(qū)和30%無序非晶態(tài)纖維素、半纖維素區(qū)組成的，高速有序的纖維素區(qū)具有結(jié)晶性。在衍射曲線中，結(jié)晶結(jié)構對應著尖峰衍射，非晶結(jié)構對應著彌散衍射特征見圖3。

圖3 茶葉膳食纖維粉、其中的不可溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維X 射線衍射圖Fig.3 X ray diffractometer of tea dietary fiber powder，insoluble dietary fiber and soluble dietary fiber

由圖3可知，茶膳食纖維粉也是具有結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)兩項共存的晶體。

2.5 茶葉膳食纖維體外對腸道菌群的影響分析結(jié)果

體外發(fā)酵過程中乳酸菌的數(shù)量變化見表2。乳酸菌產(chǎn)生有機酸降低腸道pH 值抑制腐敗菌的增殖，維持腸道菌群平衡，提高機體免疫力，促進宿主代謝，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增加維生素的合成[18]。與對照組相比，茶膳食纖維均可增加乳酸菌生長，但是最優(yōu)增殖是中膳食纖維梯度組，發(fā)酵24 h 后，可顯著增加乳酸菌數(shù)量（p〈0.05）。而高膳食纖維組反而對乳酸菌的增殖有一定的抑制作用。因此最優(yōu)是中膳食纖維組。

腸道中以雙歧桿菌為代表的厭氧菌是典型的益生菌，可抗腫瘤、降低膽固醇以及延緩衰老等，此外還有抑制致病菌粘附的作用，抗菌消炎、通便等一系列生物活性[19]。發(fā)酵24 h，茶粉均可顯著提高雙歧桿菌數(shù)量（p〈0.05），且低、中、高劑量組無顯著差異。

腸桿菌為動物或人腸道內(nèi)的條件致病菌，微生態(tài)平衡狀況下是無害的，但一旦過量會引起疾病。與對照組相比，發(fā)酵24 h 后，茶粉可降低腸桿菌數(shù)量，但是沒有顯著性差異（p〉0.05），其中高濃度膳食纖維組抑制腸桿菌效果最好。

表2 茶葉膳食纖維體外發(fā)酵對腸道菌群數(shù)量的影響（平均值±SD，n=3）Table 2 The influence of tea dietary fiber on the number of intestinal microflora in vitro（average± SD，n=3）

與對照組相比，發(fā)酵24 h 后，茶粉可顯著降低腸球菌數(shù)量（p〈0.05），其中中膳食纖維和高膳食纖維抑制效果均好，且無顯著性差異（p〉0.05）。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種厭氧型革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢桿菌，普遍存在于自然界及人類和動物的腸道中，可引起壞死性腸炎、腸毒血癥，同時也是人類食物中毒的主要病原菌之一。發(fā)酵24 h，茶粉均可顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量（p〈0.05），其中高濃度膳食纖維組抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌效果最好，但是和中、低濃度相比無顯著性差異（p〉0.05）。

擬桿菌在營養(yǎng)吸收、促進免疫系統(tǒng)發(fā)育、幫助宿主分解多糖、加快腸粘膜血管形成及平衡腸道菌群方面起到了關鍵作用。發(fā)酵24 h，茶粉對擬桿菌數(shù)量無顯著變化。

2.6 茶葉膳食纖維發(fā)酵液中pH和短鏈脂肪酸的變化分析結(jié)果

茶膳食纖維發(fā)酵過程中pH 值的變化見圖4。

圖4 茶膳食纖維發(fā)酵過程中pH 值的變化Fig.4 Effect of tea dietary fiber on pH in fermentation process

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，各組發(fā)酵液的pH 值都在顯著降低（p〈0.05）。隨著茶膳食纖維濃度的增加，發(fā)酵液中pH 值可顯著降低，其中3 %膳食纖維粉效果最顯著，這是由于茶膳食纖維樣品通過腸道微生物的代謝會產(chǎn)生不同類型的酸性物質(zhì)，如短鏈脂肪酸，從而影響發(fā)酵液的pH 值。隨著發(fā)酵的進行，腸道菌群在發(fā)酵液中產(chǎn)生了各種有機酸，降低了發(fā)酵液的pH 值。茶膳食纖維發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸含量見圖5。

圖5 膳食纖維發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸含量（平均值±SD，n=3）Fig.5 Effect of tea dietary fiber on the contents of short-chain fatty acids（SCFAs）in fermentation process（average ± SD，n=3）

由圖5可見，乙酸是多數(shù)細菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物，能夠合成膽固醇，進入人體參與物質(zhì)代謝和合成。其中發(fā)酵24 h，3%茶膳食纖維樣品組乙酸含量最高為（20.65±0.93）mmol/L。丙酸可以影響肝臟和膽固醇的代謝，且丙酸的增加還能減弱膽固醇的合成，對人體結(jié)腸健康產(chǎn)生積極作用，能抑制癌細胞生長。發(fā)酵24 h 后，2%和3%茶膳食纖維均能顯著提高丙酸含量。丁酸在腸道中提供能量，發(fā)酵24 h 后，3%茶膳食纖維丁酸含量最高，為（10.89±1.01）mmol/L。乳酸是腸道微生物發(fā)酵的重要產(chǎn)物，可以體現(xiàn)腸道細菌生長的情況。發(fā)酵24 h 后，3%茶膳食纖維樣品乳酸含量最高，為（19.91±1.38）mmol/L，然而與 2%茶膳食纖維樣品無顯著性差異（p〉0.05）。

3 結(jié)論

茶膳食纖維對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，可促進益生菌生長，抑制有害致病菌的生長?？娠@著增加腸道乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，且顯著抑制腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，對擬桿菌沒有影響。2%和3%茶膳食纖維均可達到理想益生作用，但是高劑量的茶膳食纖維（3%）會對乳酸菌生長有一定抑制作用，因此并不是越高濃度越理想。隨著茶膳食纖維濃度的增加，發(fā)酵液的pH值顯著降低。隨著茶膳食纖維濃度的增加，SCFAs 各酸含量不斷增加，乙酸含量最高為（20.65±0.93）mmol/L，丙酸含量最高為（2.88±0.14）mmol/L，丁酸含量最高為（10.89±1.01）mmol/L，乳酸含量最高為（19.91±1.38）mmol/L，然而與2%茶膳食纖維相比，并無顯著性差異，因此結(jié)合腸道菌群結(jié)果和SCFAs 結(jié)果，最優(yōu)膳食纖維比例為2%茶膳食纖維可對腸道菌群有益生調(diào)節(jié)作用。