北五味子中總木脂素類成分的抗氧化及抗炎活性研究

馬瑩慧，馮波，朱鶴云，郭淑英，張慧鋒，于歡

（吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

五味子屬木蘭科植物，是傳統(tǒng)中藥材，主要產(chǎn)地為東北三省。五味子性溫、味酸、甘、有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、抗腫瘤等功能。對(duì)久瀉不止、久嗽虛喘、短氣脈虛、心悸失眠等癥均有良好治療作用[1]。五味子醇提物主要含有木脂素、多種油性成分、多糖、全氮及氨基酸等成分，其中木脂素類為主要活性成分，為一種天然化合物，具有抗氧化、保肝、抗炎等作用[2-5]。例如苑廣信利用過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷的胰島細(xì)胞RINm5F 為模型，通過噻唑藍(lán)比色法（hiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（model driven architecture，MDA）含量來研究五味子提取物的抗氧化活性及機(jī)制，結(jié)果顯示五味子提取物對(duì)胰島細(xì)胞有增殖作用，并呈劑量依賴性；五味子提取物還對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷的胰島細(xì)胞有保護(hù)作用，通過與模型組對(duì)比，顯示其具有濃度依賴性的抗氧化保護(hù)作用；當(dāng)五味子提取物高時(shí)、中劑量組培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)MDA 含量明顯減少、SOD活力明顯增強(qiáng)，說明細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)[6]。姚瑩等采用四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，比較了南、北五味子中木脂素對(duì)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）活性及肝組織勻漿MDA 水平的影響，并同時(shí)觀察肝組織病理學(xué)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)南、北五味子中木脂素均能明顯降低急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量，降低肝組織MDA 的水平，肝臟病理損傷有明顯的改善[7]。本試驗(yàn)選取5種木脂素成分對(duì)照品作為定量指標(biāo)，對(duì)五味子中木脂素化合物進(jìn)行純化，并研究其抗氧化、抗炎作用及機(jī)制，為今后更深一步的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀：日本島津公司；Rotavapor R-3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；Scientz-12SN 冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800 型紫外分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；T-100 酶標(biāo)儀：美國伯樂公司；Heal ForceHF90 CO2培養(yǎng)箱：上海力新儀器有限公司。

1.2 試劑及材料

北五味子：市售；五味子醇甲（Y17M8H31887）、五味子醇乙（P28S6F3984）、五味子酯甲（SO1030KA12）、五味子甲素（Z21A8B34395）、五味子乙素（P29J8066）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（分析純）：江蘇漢邦科技有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia 公司；HPD100型樹脂：東鴻化工有限公司；一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所；VC對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司；鄰苯三酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；溴化噻唑藍(lán)四氮唑：普洛麥格生物科技有限公司；二甲基亞砜、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國 Sigma；胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、DMEM 培養(yǎng)液：美國Gibco；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（Interleukinin-10，IL-10）試劑盒：武漢博士德生物園工程有限公司。

1.3 五味子總木脂素類化合物提取純化方法

取干燥的五味子粉碎成粗粉，過40 目篩，晾干，稱重。采用8 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次提取1 h。合并兩次提取液，抽濾，將濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收乙醇，加入適量蒸餾水制成濃度為0.15 g/mL 五味子總木脂素提取液。以HPD100 大孔吸附樹脂純化北五味子總木脂素類化合物，上樣量為7 BV，吸附流速和洗脫流速均控制在2 BV/h，徑高比為1∶6，洗脫溶劑為95%乙醇，洗脫量為11 BV，洗脫液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收乙醇后冷凍干燥得固體粉末，即為五味子總木脂素類化合物。

1.4 五味子總木脂素類化合物樣品濃度測(cè)定

LC-20AT 型高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Diamonsil C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），柱溫 30℃，進(jìn)樣量10 μL，體積流量1.00 mL/min，檢測(cè)波長為254 nm，流動(dòng)相為 A（乙腈）-B（水），梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，20 %～60 % A；10 min～15 min，60 %～61 % A；15 min～20 min，61 %～62 % A；20 min～25 min，62 %～63 % A；25 min～30 min，63 %～64 % A；30 min～35 min，64 %～65 %A；35 min～40 min，65%～70%A；40 min～45 min，70%～75%A；45 min～55 min，75%～80%A。

精密稱取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素對(duì)照品適量，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成含五味子醇甲濃度為0.1 mg/mL、醇乙濃度為0.05 mg/mL、酯甲濃度為0.05 mg/mL、甲素濃度為0.05 mg/mL、乙素濃度為0.05 mg/mL 的對(duì)照品混合溶液，備用。精密吸取五味子對(duì)照品混合溶液適量，配置成系列對(duì)照品溶液，以質(zhì)量濃度（X）-峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得到5種木脂素對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取五味子總木脂素類化合物樣品溶液置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)有機(jī)濾膜（0.45 μm）過濾后測(cè)定濃度。

1.5 抗氧化活性的研究

1.5.1 樣品溶液的制備

精密稱定提取純化后的五味子總木脂素類化合物凍干粉末適量，分別配制成濃度為0.05、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液各1 mL；精密稱取VC對(duì)照品1 mg，配制成濃度為0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.5.2 總抗氧化能力的測(cè)定

按照T-AOC 試劑盒的總抗氧化能力測(cè)定操作步驟進(jìn)行測(cè)定，分別配制樣品管、對(duì)照管、VC對(duì)照管的待測(cè)溶液。采用紫外分光光度法，用蒸餾水調(diào)零，在520 nm 處測(cè)定各溶液吸光度值，并與同等濃度的VC對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照[8]。

式中：ODT為測(cè)定 OD 值；ODC為對(duì)照 OD 值。

1.5.3 對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的考察

分別設(shè)定空白管、對(duì)照管、VC對(duì)照管和濃度分別為 0.2、0.1、0.05 mg/mL 的高、中、低濃度樣品組?？瞻坠芎蛯?duì)照管均加入4 mL 蒸餾水，VC對(duì)照管加入4 mL已知濃度的VC對(duì)照品溶液，樣品組分別加入各自濃度樣品溶液4 mL。再向各管中加入0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-Hcl]緩沖溶液（pH=8.2）4.5 mL，放入溫度為25℃的水浴鍋中傳溫20 min，除空白管外其余各管分別加入0.5 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，空白管以同體積蒸餾水代替，振搖后馬上在320 nm 處測(cè)定吸光度值，調(diào)零用空白管，每30 s 測(cè)一次，4 min 時(shí)停止。將所得數(shù)據(jù)橫坐標(biāo)用t 表示，縱坐標(biāo)用An 表示做回歸方程，得到的直線斜率Vx 即為反應(yīng)速率[9-10]。

式中：V對(duì)照為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V樣品為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V對(duì)照回歸方程為Y=0.061 4x+0.056 4。

1.6 抗炎活性的研究

1.6.1 炎癥細(xì)胞模型的建立

首先利用MTT 法確定最大給藥濃度，將RAW264.7 細(xì)胞按 1×105/mL，200 μL/孔接種于 96 孔板中，接種細(xì)胞總數(shù)為2×104個(gè)/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中，溫度37℃，CO2濃度5%，培養(yǎng)48 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含有不同終濃度的含藥（總木脂素純化物、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素）DMEM 培養(yǎng)液 200 μL，空白組只加 DMEM 200 μL，各組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2.5 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加 1.0 mg/mL 的 MTT 100 μL 培養(yǎng) 4 h，棄去 MTT，每孔加 DMSO100 μL 振搖 20 min，在 570 nm 處測(cè)定吸光度值，計(jì)算抑制率。

抑制率 IC/%=（1-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白組×100

根據(jù)抑制率〉98%的藥物濃度為安全給藥劑量，再按照3×105個(gè)/mL 將細(xì)胞接種于六孔板中，每孔加入2 mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，鏡下觀察細(xì)胞90 %融合，分別建立正常組（加入DMEM 培養(yǎng)液100 μL）、LPS組（加入含終濃度為10 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)液100 μL）和藥物組（分別為含終濃度為2 mg/mL 純化物+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養(yǎng)液 100 μL、含終濃度為 0.02 mg/mL 五味子醇甲+10 μg/mL LPS 的 DMEM培養(yǎng)液100 μL、含終濃度為0.02 mg/mL 五味子醇乙+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養(yǎng)液 100 μL、含終濃度為0.02 mg/mL 五味子酯甲+10 μg/mLLPS 的 DMEM 培養(yǎng)液100μL、含終濃度為 0.02 mg/mL 五味子甲素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養(yǎng)液 100 μL、含終濃度為 0.02 mg/mL五味子乙素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養(yǎng)液 100 μL），置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，待測(cè)。

1.6.2 IL-10、TNF-α 和 NO 的測(cè)定

將待測(cè)樣品按照ELISA 試劑盒的說明進(jìn)行加樣測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔，加樣完畢后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-10 和TNF-α 的濃度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度用橫坐標(biāo)表示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平均OD 值用縱坐標(biāo)表示，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品3 次測(cè)量的平均OD 值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：Y=0.002 1x+0.148 6 R2=0.990 2（IL-10，濃度為 pg/mL）和 Y=0.002 2x+0.101 3 R2=0.997 4（TNF-α，濃度為 ng/mL）。

將待測(cè)樣品按照一氧化氮測(cè)試盒的說明配制所需的試劑，再按照操作表分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管（總木脂素純化物、五味子醇甲對(duì)照品、五味子醇乙對(duì)照品、五味子酯甲對(duì)照品、五味子甲素對(duì)照品、五味子乙素對(duì)照品）溶液，混勻配制完成的溶液，放在37℃恒溫箱中10 min，用UV1800 紫外光度計(jì)在光徑0.5 cm、波長550 nm 處用測(cè)定各管的吸光度值（蒸餾水調(diào)零）。

NO 含量/（μmol/L）=（測(cè)定OD 值-空白OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn) OD 值-空白 OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100 μmol/L）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子總木脂素類化合物濃度的測(cè)定

將供試品溶液按“1.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得色譜圖見圖1，與對(duì)照品混合溶液色譜圖對(duì)照，確定5個(gè)色譜峰見表1。5種木脂素對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

圖1 供試品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography（HPLC）diagram of trial

表1 高效液相色譜法鑒定北味子中木脂素類成分Table 1 Identification of lignans in Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.by HPLC

表2 5種木脂素對(duì)照品回歸方程Table 2 Five lignans reference substance regression equation

由表2可知5種成分線性關(guān)系在各自濃度范圍內(nèi)均良好。五味子總木脂素類化合物樣品溶液中5種木脂素成分含量總和為56%，說明經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，總木脂素純度較高，為接下來的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 抗氧化活性的研究

2.2.1 總抗氧化能力的測(cè)定

按照總抗氧化能力試劑盒的操作方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果Table 3 Total antioxidant capacity test results

由表3結(jié)果可知，北五味子總木脂的總抗氧化能力隨著濃度的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；與同等濃度的VC對(duì)照品相比，北五味子總木脂素類成分的總抗氧化能力是VC的1/7 左右，說明五味子中總木脂素成分總抗氧化能力較好。

2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的考察

超氧陰離子自由基作為生物體所產(chǎn)生的一種自由基，與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，測(cè)定中藥提取物對(duì)超氧陰離子的清除效果，可提示其抗氧化作用及對(duì)疾病治療機(jī)理[11-12]。按照1.5.3 方法測(cè)定不同濃度北五味子總木脂素的超氧陰離子自由基清除，結(jié)果見表4。

表4 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定結(jié)果Table 4 Superoxide anion free radical scavenging rate measurement result

由表4可知，北五味子總木脂素清除超氧陰離子自由基的強(qiáng)度隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)；與同等濃度的VC對(duì)照品相比，北五味子總木脂素類成分清除超氧陰離子自由基的強(qiáng)度是VC的1/6 左右，說明其能夠較好的清除超氧陰離子自由基。

2.3 抗炎活性的研究

MTT 比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法，其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，甲瓚可被二甲基亞砜溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm 波長處測(cè)定其光吸收值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，該法可用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，反映中藥提取物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，確定最大給藥劑量。按照1.6.1 方法進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 MTT 試驗(yàn)結(jié)果Table 5 MTT test results

續(xù)表5 MTT 試驗(yàn)結(jié)果Continue table 5 MTT test results

由表5中數(shù)據(jù)可知，提取純化后總木脂素純化物在含量低于2 mg/mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞無毒性。各對(duì)照品溶液在含量低于0.02 mg/mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞也是無毒性的，但隨著他們各自含量的增高，各對(duì)照品溶液就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用，其中五味子對(duì)照品甲素和五味子對(duì)照品醇甲隨著濃度的增加對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性增加顯著。而五味子對(duì)照品醇乙、五味子對(duì)照品酯甲和五味子對(duì)照品乙素濃度升高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性增加不大，因此選用0.02 mg/mL 濃度的5種對(duì)照品來進(jìn)行抗炎試驗(yàn)研究。

小鼠單核巨噬細(xì)胞Raw264.7可分泌多種炎癥相關(guān)因子參與機(jī)體免疫應(yīng)答，按照1.6.2 方法利用Elisa法測(cè)定北五味子總木脂素類成分及5種五味子木脂素對(duì)照品對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)因子的影響，結(jié)果見表6。

表6 總木脂素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-10、TNF-α 和NO 的影響Table 6 Effects of total lignans on IL-10，TNF-α and NO secretion by mouse macrophages

IL-10 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，為炎癥抑制因子。由表6中數(shù)據(jù)可知，5種對(duì)照品溶液均可促進(jìn)IL-10 的分泌，其中甲素作用最強(qiáng)、醇乙作用較差，提取純化后的五味子總木脂素純化物可使IL-10 含量顯著升高。TNF-α 是腫瘤壞死因子的一種，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生TNF-α 的主要細(xì)胞，為炎癥促進(jìn)因子。5種對(duì)照品對(duì)LPS 作用后的小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α均有一定的抑制效果，其中五醇乙作用最強(qiáng)、甲素作用較差，提取純化后的總木脂素純化物對(duì)TNF-α 的抑制效果較好。硝酸還原酶催化硝酸離子還原成亞硝酸離子的反應(yīng)稱為硝酸還原酶法，它是一種氧化還原酶。5種對(duì)照品溶液和五味子總木脂素純化物都可使由LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生的NO 濃度降低，其中酯甲作用最強(qiáng)、而醇乙作用較差，提取純化后的總木脂素純化物效果較好。

綜合上述3種因子的測(cè)定結(jié)果，說明北五味子總木脂素具有一定的抗炎活性，優(yōu)于部分木脂素對(duì)照品，并且，不同的木脂素類成分在發(fā)揮抗炎方面發(fā)揮著不同的作用[13-16]。

3 結(jié)論

油脂自動(dòng)氧化是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)過程中可產(chǎn)生多種氧自由基，這些氧自由基具有很高的反應(yīng)活性，能與人體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA 等大分子物質(zhì)結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致人體衰老，并引發(fā)癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化和白內(nèi)障等多種疾病；同時(shí)油脂氧化過程中產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)，不僅可導(dǎo)致食品的營養(yǎng)及感官特性發(fā)生劣變，而且可以誘發(fā)致突變物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)，成為人體衰老的主要因素就是某些自由基的產(chǎn)生和存在。該文采用總抗氧化能力和超氧陰離子自由基清除率兩種方法對(duì)北五味子中總木脂素的抗氧化活性進(jìn)行考察，測(cè)定的方法簡便、快速且穩(wěn)定性好。試驗(yàn)從整體和部分分別考察，使結(jié)果更加客觀明了，從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，北五味子總木脂素達(dá)到一定濃度時(shí)就可發(fā)揮一定的抗氧化活性，本試驗(yàn)對(duì)日后研發(fā)清除超氧陰離子自由基的天然藥抗氧化藥物奠定了基礎(chǔ)。中藥對(duì)人體的傷害小，不易產(chǎn)生抗藥性，并且來源廣泛，本文通過ELISA 試劑盒和一氧化氮試劑盒對(duì)北五味子總木脂素進(jìn)行了抗炎活性的研究。結(jié)果顯示純化后的五味子總木脂素和5種對(duì)照品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10 和NO 都具有一定的影響，表明總木脂素具有一定的抗炎作用，但是試驗(yàn)只是對(duì)總木脂素的抗炎作用進(jìn)行了一些細(xì)胞層面的研究，在醫(yī)學(xué)上并沒有給出明確的防治意義，需要在今后的研究中結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及其他相關(guān)試驗(yàn)做更深一步的討論。北五味子中總木脂素具有良好的抗氧化、抗炎等作用，有研究表明五味子果梗和葉片中有與五味子果實(shí)相同的木脂素類成分，可作為五味子果實(shí)的良好替代品。若能將五味子各個(gè)部分都加以良好應(yīng)用，運(yùn)用精密的提取純化工藝，在以后的生產(chǎn)中可以得到大批量含有藥理活性成分的原料，則可在中藥研發(fā)和保健品生產(chǎn)研發(fā)上做出巨大貢獻(xiàn)。