溫度對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響及其預(yù)測(cè)研究

朱蕾，張愛(ài)靜，王鵬杰，李琳瓊，高瑀瓏

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

假單胞菌是一種能在低溫下生長(zhǎng)的食品腐敗菌，極易污染肉制品、乳制品和蔬菜等食品并引起腐敗變質(zhì)。因此，該菌是引起食品腐敗變質(zhì)的重要微生物[1]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌中最常見(jiàn)的一個(gè)種，又稱綠膿桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤以及人體的呼吸道、皮膚和腸道等處，尤其在潮濕的自然環(huán)境中更易生長(zhǎng)繁殖，所以其傳播途徑廣泛[2]，該菌是一種條件性致病菌，可引起人類急性腸道炎、皮膚炎、敗血病和腦膜炎等疾病，其產(chǎn)生的內(nèi)、外毒素具有致病性，內(nèi)毒素能引起系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory responsible syndrome，SIRS），對(duì)于老人、小孩等抵抗力較弱的群體危害較大，其外毒素侵入敏感細(xì)胞后，引起哺乳動(dòng)物蛋白合成受阻，臨床上常引起繼發(fā)性感染[3-4]。2014年之前，在食品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)工作中對(duì)其監(jiān)控較少，與食物中毒相關(guān)的報(bào)道較少，但由于其對(duì)抗生素等化學(xué)治療劑有較強(qiáng)的抵抗性[5]，分布廣，在食品中污染機(jī)會(huì)較多，有報(bào)道建議將銅綠假單胞菌列入食物中毒致病菌的目錄中[6]。2003年黃美子等[7]報(bào)道了食用新鮮豬肉后出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀的案例，經(jīng)衛(wèi)生防疫鑒定是由銅綠假單胞菌引起的。2010年沈瑛等[8]也報(bào)道出銅綠假單胞菌引起食物中毒的事件。2014年我國(guó)對(duì)瓶裝飲用水等衛(wèi)生檢測(cè)進(jìn)行了修訂，增加對(duì)銅綠假單胞菌的監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)，將其確認(rèn)為食源性和水源性致病菌。隨著人們對(duì)食品安全的重視，食品微生物安全預(yù)測(cè)是人們目前關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。食品微生物預(yù)測(cè)學(xué)是一門基于微生物學(xué)、應(yīng)用計(jì)算機(jī)學(xué)、工程數(shù)學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)等的綜合學(xué)科。微生物預(yù)測(cè)模型的建立有利于食品在貯藏、運(yùn)輸和銷售等期間內(nèi)微生物變化的監(jiān)測(cè)，了解其存活信息[10]，為食品的微生物安全控制提供科學(xué)理論依據(jù)[11]。微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型主要有一級(jí)模型、二級(jí)模型。一級(jí)模型是描述微生物數(shù)量對(duì)時(shí)間的函數(shù)，常見(jiàn)的一級(jí)模型有Linear模型、Logistic[12]模型和Gompertz[13]模型等。Linear模型的操作簡(jiǎn)便，但預(yù)測(cè)的精確度不高；Logistic模型在數(shù)學(xué)上是用于描述一個(gè)普通笛卡爾平面上的S形曲線，有人將其用于研究細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，但其不能完整顯示S形曲線，是一個(gè)無(wú)遲滯期的S形曲線[12]，而Gompertz模型克服了這些缺點(diǎn)，目前應(yīng)用較多[9]。Gompertz模型能夠較好地用于研究單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)曲線，在研究細(xì)菌生長(zhǎng)的遲滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期時(shí)，分別用遲滯時(shí)間（λ）、最大比生長(zhǎng)速率（μmax）、最大菌落數(shù)（b）來(lái)描述這3個(gè)階段的特征。在食品儲(chǔ)藏期間，λ可用于分析食品貨架期的參數(shù)，表示食品安全儲(chǔ)存時(shí)間的長(zhǎng)短；μmax是微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，表示食品腐敗變質(zhì)的速率；b表示在腐敗變質(zhì)的食品中，微生物的最大生長(zhǎng)量。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)一些食品基質(zhì)中微生物生長(zhǎng)模型的建立已有一些報(bào)道，但是對(duì)于銅綠假單胞菌預(yù)測(cè)模型的研究鮮有報(bào)道。鄒宇等[14]運(yùn)用Gompertz模型、Logistic模型建立了在低溫下李斯特氏菌的生長(zhǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Gompertz模型為李斯特氏菌在牛奶中生長(zhǎng)的最適模型；M?ller等[15]在新鮮牛肉中建立了沙門氏菌的生長(zhǎng)模型；Yong[13]等用Gompertz和Logistic模型擬合了生豬肉中李斯特氏菌的生長(zhǎng)曲線。目前用來(lái)研究微生物生長(zhǎng)常用的二級(jí)模型有Ratkowsky[16]模型、Square Root[17]平方根模型、二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型[18]、Arrhenius模型[9，19]。Square Root模型沒(méi)有生物學(xué)基礎(chǔ)，是基于觀察，認(rèn)為微生物最大比生長(zhǎng)速率的平方根與生長(zhǎng)溫度成線性關(guān)系；二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型是研究多種因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)的影響，其中的參數(shù)也沒(méi)有明確的物理意義；Arrhenius模型最初是用來(lái)表征化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)速率與溫度之間的關(guān)系，有人也曾用此模型來(lái)預(yù)測(cè)微生物的生長(zhǎng)，因誤差較大，目前應(yīng)用較少。研究溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)速率的影響，常采用Ratkowsky模型。目前對(duì)于新增的食源致病性銅綠假單胞菌安全預(yù)測(cè)的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在以食源致病性銅綠假單胞菌為研究對(duì)象，為預(yù)測(cè)其安全性，本研究基于Gompertz模型、Ratkowsky模型、Hyperbola[20]模型研究銅綠假單胞菌從6℃到48℃的生長(zhǎng)；研究生長(zhǎng)溫度對(duì)銅綠假單胞菌最大比生長(zhǎng)速率μmax與遲滯時(shí)間λ的影響；將μmax與λ的乘積定義為菌體細(xì)胞的生理狀態(tài)參數(shù)h0，研究生長(zhǎng)溫度對(duì)菌體h0的影響。建立銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)一級(jí)模型；建立生長(zhǎng)溫度對(duì)最大比生長(zhǎng)速率μmax、遲滯時(shí)間λ影響的預(yù)測(cè)二級(jí)模型，為其在食品中的安全控制奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853：北京微生物研究所，采用胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入TSB液體培養(yǎng)基，于37℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

1.2 主要儀器與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）：南京丁貝生物科技有限公司。

BSC-1300ⅡA2型生物安全柜：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Scan1200型自動(dòng)影像分析菌落計(jì)數(shù)儀：法國(guó)Intersicence公司；ZQTY-70S型大容量低溫?fù)u床：上海知楚儀器有限公司；HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；101-3AS電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；Sartorious精密電子天平：北京塞多斯天平有限公司；BCD-196T型冰箱：青島海爾股份有限公司；微生物試驗(yàn)常規(guī)儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度的生長(zhǎng)及平板菌落計(jì)數(shù)

將1.1節(jié)制備的ATCC27853菌懸液接種于TSB培養(yǎng)基中，然后分別置于6、10、16、22、28、36、42、45、48、50℃下，140 r/min振蕩培養(yǎng)，每個(gè)溫度在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣并菌落計(jì)數(shù)，不同的培養(yǎng)溫度選取不同的時(shí)間間隔取樣并在TSA平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。按文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行菌落記數(shù)。ATCC27853的生長(zhǎng)量的表達(dá)：計(jì)算每毫升培養(yǎng)基中活菌的數(shù)量（CFU/mL），然后用以10為底的對(duì)數(shù)來(lái)表示lg（CFU/mL）。

1.3.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長(zhǎng)的一級(jí)Gompertz模型的建立

本研究利用Gompertz模型來(lái)擬合ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃的溫度下的生長(zhǎng)曲線，建立ATCC27853在不同溫度下生長(zhǎng)的一級(jí)模型，Gompertz模型見(jiàn)（1）式

式中：Nt為在某時(shí)間t，ATCC27853菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；a為（時(shí)間t=0時(shí)）ATCC27853初始菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；b為ATCC27853最大菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；c為ATCC27853在d時(shí)刻的最大生長(zhǎng)速率，h-1；d為達(dá)到最大生長(zhǎng)速率時(shí)所用的時(shí)間，即生長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)，h。

細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率μmax和遲滯時(shí)間λ是用來(lái)描述其生長(zhǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。ATCC27853的μmax、λ與Gompertz模型的相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系[22]分別見(jiàn)（2）和（3）式

式中：μmax為ATCC27853的最大比生長(zhǎng)速率，h-1；a為（時(shí)間t=0時(shí)）ATCC27853初始菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；b為ATCC27853最大菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；c為ATCC27853在d時(shí)刻的最大生長(zhǎng)速率，h-1；e為自然常數(shù)，等于2.718 28。

式中：λ為ATCC27853的遲滯時(shí)間，h；c為在d時(shí)刻的最大生長(zhǎng)速率，h-1；d表示達(dá)到最大生長(zhǎng)速率時(shí)所用的時(shí)間，即生長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)，h。

將（2）、（3）式代入（1）式中，則Gompertz模型可轉(zhuǎn)化為（4）式

式中：Nt表示某時(shí)間t，ATCC27853每毫升菌懸液中菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；N0為時(shí)間t為0時(shí)，ATCC 27853每毫升菌懸液中初始菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；Nmax為ATCC27853最大菌數(shù)的對(duì)數(shù)，lg（CFU/mL）；λ 為ATCC27853的遲滯時(shí)間，h；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；e為自然常數(shù)，等于2.718 28。

微生物生長(zhǎng)的遲滯期是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后，因代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境的需要，RNA含量增加，核糖體、酶類和ATP等內(nèi)含物的合成加速，新的細(xì)胞成分被合成，細(xì)胞形態(tài)和體積變大，但這一階段細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有增加。本研究中，我們將這一階段的這種生理、代謝狀態(tài)稱之為細(xì)胞的生理狀態(tài)，用參數(shù)h0來(lái)表示[13]，用來(lái)描述細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，h0與遲滯時(shí)間λ和最大比生長(zhǎng)速率μmax的關(guān)系[23]見(jiàn)（5）式

式中：h0為細(xì)胞生理狀態(tài)參數(shù)；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；λ 為ATCC27853 的遲滯時(shí)間，h。

1.3.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長(zhǎng)的二級(jí)Ratkowsky 和Hyperbola 模型的建立

在一級(jí)模型的基礎(chǔ)上建立的二級(jí)模型，研究生長(zhǎng)溫度對(duì)一級(jí)模型參數(shù)的影響。利用Ratkowsky 模型，研究最大比生長(zhǎng)速率與溫度的關(guān)系，見(jiàn)（6）式

式中：μmax為在溫度T 下的最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Tmin為ATCC27853 生長(zhǎng)代謝活力為零時(shí)的最低溫度，℃；Tmax為ATCC27853 生長(zhǎng)代謝活力為零時(shí)的最高溫度，℃；m、n 為常數(shù)，單位分別為℃-1h-0.5和℃-1。

基于Hyperbola 模型，將ATCC27853 遲滯時(shí)間λ取自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化成ln（λ），研究遲滯時(shí)間和溫度之間的關(guān)系，見(jiàn)（7）式

式中：λ 為ATCC27853 生長(zhǎng)的遲滯時(shí)間，h；q 為微生物的最低生長(zhǎng)溫度，℃；p 為當(dāng)生長(zhǎng)溫度大于最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，遲滯時(shí)間減少所對(duì)應(yīng)的溫度的升高量，℃。

1.3.4 模型的評(píng)價(jià)及其驗(yàn)證

采用MATLAB 2016b 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行Gompertz、Ratkowsky 和Hyperbola 模型的建立。模型的評(píng)價(jià)采用決定系數(shù)R2、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、準(zhǔn)確因子Af和偏差因子Bf。其中，R2和RMSE 表示模型的精確度、可靠性，R2越接近于1，RMSE 越小，模型擬合度越高；Af用于衡量預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間的接近程度[24-25]，Af越接近于1 模型的擬合越好，Af值越小，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值越接近，模型越精確；Bf〉1 表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值高，當(dāng)Bf〈1表示模型預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值低，Bf越接近1，模型擬合度也越高[26]。

模型的驗(yàn)證采用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確因子Af和偏差因子Bf。一級(jí)模型的驗(yàn)證，在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃的溫度下生長(zhǎng)，每個(gè)生長(zhǎng)溫度取不同于模型建立的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣驗(yàn)證。二級(jí)模型的驗(yàn)證，設(shè)置不同的生長(zhǎng)溫度12、19、25、39、44℃進(jìn)行取樣驗(yàn)證，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次；相關(guān)計(jì)算見(jiàn)（8）、（9）和（10）式

式中：n 表示測(cè)定值的個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長(zhǎng)的一級(jí)Gompertz模型的建立

ATCC27853 在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃下生長(zhǎng)的Gompertz 模型曲線和50℃的失活情況見(jiàn)圖1。

圖1 銅綠假單胞菌ATCC27853 在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃下生長(zhǎng)的Gompertz 一級(jí)模型曲線以及50℃的失活情況Fig.1 Growth curves of Gompertz primary model for P.aeruginosa ATCC27853 under the temperatures of 6，10，16，22，28，36，42，45，48℃and inactivation at 50℃

由圖1可以看出，除50℃外，其余溫度的實(shí)測(cè)值皆比較均勻地分布于預(yù)測(cè)生長(zhǎng)曲線的兩側(cè)，說(shuō)明利用Gompertz 模型能較好地?cái)M合ATCC27853 從6℃～48℃的生長(zhǎng)曲線，從低到高這9個(gè)溫度下ATCC27853 的生長(zhǎng)曲線基本均呈現(xiàn)“S”型，有遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期三部分。對(duì)于遲滯期，在低溫度下，遲滯期較為明顯，如，在10℃下，遲滯時(shí)間約為30 h，當(dāng)生長(zhǎng)溫度超過(guò)28℃后，遲滯期就變得很短，如，在28、36、42℃下僅用2個(gè)多小時(shí)就能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體能很快適應(yīng)新的環(huán)境；進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，不同生長(zhǎng)溫度的對(duì)數(shù)期差異顯著（P〈0.05），如6℃的對(duì)數(shù)期約400 h，而36℃的只需約10 h，表明ATCC27853 在不同溫度下的生長(zhǎng)速度不同；進(jìn)入穩(wěn)定期后，在10℃～42℃下，菌體最大生長(zhǎng)量為9.22 lg（CFU/mL）～9.39 lg（CFU/mL），差異不顯著（P 〉0.05）；在6、45、48℃下的菌體最大生長(zhǎng)量顯著降低（P〈0.05）。ATCC27853 在50℃隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌數(shù)在降低，11 h 后，檢測(cè)不到菌體數(shù)，說(shuō)明ATCC27853在50℃下不生長(zhǎng)，已經(jīng)失活。綜上看來(lái)，生長(zhǎng)溫度是ATCC27853 生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵因素。

ATCC27853 從6℃到48℃下9個(gè)生長(zhǎng)溫度的Gompertz 模型的初始濃度（initial bacteria counts，IBC）a、最大菌落數(shù)（maximum bacteria counts，MBC）b、最大生長(zhǎng)速率（maximum growth rate，MGR）c、拐點(diǎn)（turning point，TP）d、最大比生長(zhǎng)速率（maximum specific growth rate，MSGR）μmax、遲滯時(shí)間（lag phase duration，LPD）λ和生理狀態(tài)參數(shù)（physiological state parameter，PSP）h0等參數(shù)的估計(jì)值見(jiàn)表1。

由表1可以看出，9個(gè)溫度下，菌體初始濃度a 在2.53 lg（CFU/mL）～3.53 lg（CFU/mL）之間，彼此相差小于1個(gè)lg（CFU/mL）。在16℃～45℃下生長(zhǎng)，ATCC27853菌體生長(zhǎng)最大濃度均可達(dá)到109（CFU/mL），表明在16℃～45℃，ATCC27853 生長(zhǎng)所能達(dá)到最大濃度并不隨溫度的變化而變化。當(dāng)溫度為6、10、48℃時(shí)，ATCC27853 生長(zhǎng)最大濃度分別為7.24、8.68、7.09 lg（CFU/mL），與16℃～45℃相比，差異顯著（P〈0.05），菌體的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。從6℃到48℃，最大生長(zhǎng)速率c 隨溫度的增大先增大后減小，36℃時(shí)c 值最大；拐點(diǎn)d 隨溫度的增大呈先下降再上升的趨勢(shì)，從197.57 h 減小到5.95 h 再增大到27.42 h，36℃時(shí)d 值最小。

表1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長(zhǎng)的Gompertz 一級(jí)模型參數(shù)值Table 1 The estimated vales for parameters in the growth curves of Gompertz primary model for P.aeruginosa ATCC27853 under the different temperatures

在6℃～36℃的生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)，μmax由0.015 5增長(zhǎng)到0.571 5，因?yàn)殡S著溫度的升高，ATCC27853 的代謝反應(yīng)及生長(zhǎng)速率在加快，最適生長(zhǎng)溫度36℃也是該菌生長(zhǎng)速率最高的溫度；當(dāng)生長(zhǎng)溫度為48℃時(shí)，生長(zhǎng)速率顯著降低到0.162 7（P 〈 0.05），生長(zhǎng)溫度上升到50℃時(shí)，可能是因?yàn)锳TCC27853 體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等熱敏感性大分子物質(zhì)在高溫下發(fā)生變性，細(xì)胞的生理代謝功能急劇下降，菌體死亡；對(duì)應(yīng)的遲滯期也發(fā)生相應(yīng)的變化，從107.51 h 降到1.95 h，之后又升到17.11 h，ATCC27853 在最適生長(zhǎng)溫度36℃時(shí)，遲滯期最短。在食品儲(chǔ)藏期間，一旦由微生物引起腐敗變質(zhì)，微生物的遲滯期與其貨架期有關(guān)，遲滯期越長(zhǎng)貨架期越長(zhǎng)，在較低溫和較高溫的情況下，遲滯期較長(zhǎng)，會(huì)延長(zhǎng)食品的貨價(jià)期。h0代表ATCC27853 細(xì)胞的生理狀態(tài)參數(shù)，描述細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，生理狀態(tài)參數(shù)h0越高，細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的能力越弱，由表1可以看出溫度為6℃和48℃時(shí)的生理狀態(tài)參數(shù)h0比較高，10℃～45℃時(shí)，生理狀態(tài)參數(shù)基本保持不變，差異不顯著（P〉0.05）。此外，50℃與6℃～48℃菌體的初始濃度基本相同，50℃下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ATCC27853 菌體細(xì)胞不能忍受此高溫，其數(shù)量呈下降趨勢(shì)，并于11 h 后檢測(cè)不到菌體數(shù)，表明ATCC27853菌體死亡。

2.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下一級(jí)Gompertz生長(zhǎng)模型的評(píng)價(jià)

ATCC27853 在不同溫度下生長(zhǎng)的一級(jí)Gompertz擬合模型的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 銅綠假單胞菌ATCC27853 不同溫度下生長(zhǎng)的Gompertz 擬合模型的評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Fitting evaluation of Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853 growth under different temperatures

續(xù)表2 銅綠假單胞菌ATCC27853 不同溫度下生長(zhǎng)的Gompertz擬合模型的評(píng)價(jià)結(jié)果Continue table 2 Fitting evaluation of Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853 growth under different temperatures

由表2可知，在6℃～48℃，模型的RMSE≤0.191 6，R2≥0.9956，說(shuō)明模型擬合效果較好。本研究中Af和Bf皆比較接近于1，也表明該模型的擬合度好，ATCC27853 的一級(jí)Gompertz 生長(zhǎng)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間偏差很小，沒(méi)有系統(tǒng)偏差，不會(huì)產(chǎn)生“failsafe”的情況。Ross 等[27]研究認(rèn)為，Bf在0.90～1.05 的范圍內(nèi)，模型擬合好；Bf在0.70～0.90 與1.06～1.15 之間模型擬合效果可以接受；Bf〈0.70 或Bf〉1.15，存在系統(tǒng)偏差，模型擬合不可接受。綜上分析，本研究建立的一級(jí)Gompertz 模型能很好的預(yù)測(cè)ATCC27853 從6℃到48℃溫度下的生長(zhǎng)，擬合效果好，且有效、可靠。

2.3 銅綠假單胞菌ATCC27853一級(jí)Gompertz生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證

ATCC27853 在不同溫度下生長(zhǎng)的一級(jí)Gompertz擬合模型的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 銅綠假單胞菌ATCC27853Gompertz 模型的驗(yàn)證Table 3 Validation of the Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853

利用Matlab 軟件對(duì)表3中實(shí)測(cè)值及一級(jí)模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2=0.989 0，Af=1.047 9，Bf=0.998 2，也表明Gompertz 模型的合適性及有效性，可以利用Gompertz 模型對(duì)ATCC27853 生長(zhǎng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.4 銅綠假單胞菌ATCC27853二級(jí)模型的建立

為了進(jìn)一步了解溫度對(duì)ATCC27853 生長(zhǎng)速率的影響，基于2.1 節(jié)建立的一級(jí)Gompertz 模型，利用Ratkowsky 模型來(lái)研究生長(zhǎng)溫度對(duì)最大比生長(zhǎng)速率μmax的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 銅綠假單胞菌ATCC27853 生長(zhǎng)溫度對(duì)最大比生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 The effect of the growth temperatures on maximum specific growth rate for P.aeruginosa ATCC27853

由圖2可知，隨著溫度的升高，ATCC27853 的μmax逐漸增加，直至最適生長(zhǎng)溫度36℃，當(dāng)溫度超過(guò)36℃后，μmax開(kāi)始下降，直至為零。微生物生長(zhǎng)的遲滯期是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后，要適應(yīng)新環(huán)境，一時(shí)還缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或者足夠的中間代謝物，其細(xì)胞數(shù)目不會(huì)發(fā)生變化，不過(guò)在不同的生長(zhǎng)溫度下這個(gè)適應(yīng)期是不相同的。本研究中，ATCC27853的遲滯時(shí)間為λ，λ 的自然對(duì)數(shù)ln（λ）與溫度之間的關(guān)系見(jiàn)圖3。

由圖3可知，ATCC27853 隨生長(zhǎng)溫度的升高，遲滯期λ 逐漸減小，ln（λ）降低，說(shuō)明隨著生長(zhǎng)溫度的升高，ATCC27853 細(xì)胞的代謝系統(tǒng)適應(yīng)溫度變化的時(shí)間在變短。但是，當(dāng)溫度升到48℃后，遲滯期顯著增大（P〈0.05），Hyperbola 模型不再適宜擬合生長(zhǎng)溫度與ln（λ）的關(guān)系。

ATCC27853 二級(jí)模型的參數(shù)的估計(jì)值見(jiàn)表4。

表4 二級(jí)模型參數(shù)的估計(jì)值和95%置信區(qū)間值Table 4 Estimates and 95%confidence level of parameters for the secondary models

ATCC27853 最大比生長(zhǎng)速率Ratkowsky 模型的參數(shù)表明，理論上其最低生長(zhǎng)溫度Tmin為5.6℃；最高生長(zhǎng)溫度Tmax為49.3℃，本研究所建立的具有最低生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度的ATCC27853 的生長(zhǎng)速率模型，為其在食品中的安全控制提供理論依據(jù)。ATCC27853遲滯期的Hyperbola 模型中，q 為1.7℃，是ATCC27853生長(zhǎng)最低溫度；參數(shù)Tmin和q 皆表示理論最低生長(zhǎng)溫度，試驗(yàn)表明ATCC27853 在4℃下基本不生長(zhǎng)（試驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示），Ratkowsky 模型中最低溫度的理論值與實(shí)際值更接近，同時(shí)利用Hyperbola 模型能夠快速地預(yù)測(cè)食品的安全儲(chǔ)存時(shí)間，確定其貨架期。

2.5 銅綠假單胞菌ATCC27853二級(jí)模型的評(píng)價(jià)

ATCC27853 在不同溫度下生長(zhǎng)的Ratkowsky 和Hyperbola 二級(jí)模型的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 二級(jí)模型擬合結(jié)果的評(píng)價(jià)Table 5 Fitting evaluation of the secondary models

由表5可知，RMSE≤0.151 3，R2≥0.978 3，1.157 9≤Af≤1.207 8，0.986 2 ≤Bf≤1.017 6，R2、Af和Bf皆接近于1，可以說(shuō)明二級(jí)模型擬合度較好。

2.6 銅綠假單胞菌ATCC27853二級(jí)模型的驗(yàn)證

ATCC27853 在不同溫度下生長(zhǎng)的二級(jí)模型的驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表6。

利用Matlab 軟件將試驗(yàn)所得最大比生長(zhǎng)速率的實(shí)測(cè)值與Ratkowsky 模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2=0.995 2，Af=1.090 4，Bf=0.966 4；遲滯時(shí)間自然對(duì)數(shù)的實(shí)測(cè)值與Hyperbola 模型預(yù)測(cè)值的相關(guān)性分析，R2=0.975 9，Af=1.077 7，Bf=0.997 0。表明本研究所建立的Ratkowsky 和Hyperbola 二級(jí)模型是有效和可靠的。

表6 銅綠假單胞菌ATCC27853二級(jí)模型的驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Validation of the secondary models for P.aeruginosa ATCC27853

3 討論

銅綠假單胞菌ATCC27853 是一種條件性致病菌，極易污染食品。本研究建立了從6℃到48℃下ATCC27853 生長(zhǎng)的一級(jí)和二級(jí)模型，發(fā)現(xiàn)ATCC27853能在6℃低溫下生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)溫度為48℃；研究了溫度對(duì)ATCC27853 生長(zhǎng)的影響及其預(yù)測(cè)，為其在食品中的安全控制奠定理論依據(jù)。

本研究首先利用 Gompertz 模型建立了ATCC27853 的一級(jí)生長(zhǎng)模型，基于一級(jí)生長(zhǎng)模型的參數(shù)，再結(jié)合Ratkowsky 與Hyperbola 模型分別建立了ATCC27853 的最大比生長(zhǎng)速率μmax、遲滯時(shí)間λ 與生長(zhǎng)溫度之間的二級(jí)模型。本研究發(fā)現(xiàn)Ratkowsky 與Hyperbola 模型能分別較好地建立ATCC27853 生長(zhǎng)溫度與最大比生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)溫度與遲滯時(shí)間的關(guān)系。

由參數(shù)h0可以確定ATCC27853 的生理狀態(tài)[25]。Baranyi 和Roberts 等[28]、Gospavic 等[23]和Velugoti 等[29]研究認(rèn)為不同溫度下菌體細(xì)胞的生理狀態(tài)參數(shù)基本保持恒定。Mellefont 等[30]在研究生長(zhǎng)溫度對(duì)大腸桿菌和克雷伯氏菌的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)參數(shù)h0不是恒定不變的，溫度的變化還會(huì)影響遲滯期；Delignette-Muller 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特氏菌接種前的培養(yǎng)溫度與接種后的生長(zhǎng)溫度的變化幅度與h0有一定的相關(guān)性；Xanthiakos 等[25]研究了1.5℃～16℃下單增李斯特菌的生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在1.5℃～8℃下生理狀態(tài)參數(shù)h0明顯高于在8℃～16℃生長(zhǎng)的h0。

在ATCC27853 的初始菌濃度基本相同的情況下，本研究發(fā)現(xiàn)在10℃～45℃的范圍內(nèi)，生理狀態(tài)參數(shù)h0基本保持恒定，隨溫度變化，h0變化不顯著（P〉0.05），這與Gospavic 等[23]的研究結(jié)果相一致；但在6℃時(shí)，h0明顯高于10℃～45℃的h0，此結(jié)果與Xanthiakos[25]的研究結(jié)果相一致，原因可能是低溫6℃限制了菌體細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等大分子物質(zhì)的合成。

Baranyi 和Roberts[28]的研究認(rèn)為h0=μmax× λ，α0=exp（-h0）。當(dāng)ATCC27853 的生長(zhǎng)溫度10℃時(shí)，h0=0.889 0，則 α0=41.1%，表明在此溫度下，ATCC27853菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率為最大比生長(zhǎng)速率的41.1%；在10℃～45℃時(shí) α0的平均值約為34.8%，6、48℃時(shí) α0分別為18.9%和6.2%，可以看出6、48℃的α0明顯低于10℃～45℃，生長(zhǎng)溫度為6℃和48℃比生長(zhǎng)速率明顯較低，推測(cè)可能是ATCC27853 接種前的培養(yǎng)溫度（36℃）與接種后的生長(zhǎng)溫度（6、48℃）之間存在較大的差異導(dǎo)致生理狀態(tài)較大的改變，生長(zhǎng)溫度對(duì)生理狀態(tài)的影響為預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)研究提供重要的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用Gompertz 模型建立了6℃～48℃下銅綠假單胞菌ATCC27853 的一級(jí)生長(zhǎng)模型，結(jié)合Ratkowsky 與Hyperbola 模型分別建立了ATCC27853的生長(zhǎng)溫度對(duì)其μmax和λ 影響的二級(jí)模型；用決定系數(shù)R2、均方根誤差RMSE、準(zhǔn)確因子Af和偏差因子Bf評(píng)價(jià)模型擬合優(yōu)度并驗(yàn)證了模型的有效性和可靠性，結(jié)果表明用Gompertz、Ratkowsky 與Hyperbola 模型建立的一級(jí)生長(zhǎng)模型和二級(jí)模型擬合度高；ATCC27853的生長(zhǎng)溫度對(duì)生理狀態(tài)參數(shù)h0的影響表明接種前的培養(yǎng)溫度（36℃）與被接種后的生長(zhǎng)溫度（6℃及48℃）之間存在較大的差異會(huì)導(dǎo)致生理狀態(tài)參數(shù)發(fā)生較大的改變。ATCC27853 的生長(zhǎng)溫度對(duì) μmax、λ 和h0影響的預(yù)測(cè)模型的建立，為其在食品中的安全控制提供理論依據(jù)。