鴨生長遲緩病毒抗體檢測方法的建立

池秋燕，宿 鑫，李雪松，碩 盾，滕巧泱，楊健美，劉芹防，陳鴻軍，李澤君

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，動物傳染病不斷爆發(fā)，不僅給我國的經濟造成巨大的損失，對動物生命以及人類健康也帶來嚴峻的威脅[1]。近年來我國出現(xiàn)了一種以發(fā)病鴨精神萎靡、站立不穩(wěn)、生長發(fā)育遲緩為主要特征的新發(fā)傳染性疾病[2]。該新發(fā)疫病的易感動物為櫻桃谷鴨，發(fā)病日齡主要集中在10～25日齡，少數(shù)鴨群于5～14日齡也有發(fā)病的癥狀。該病一年四季均可發(fā)生流行，發(fā)病率不高，由早期的0.1%～0.5%逐步提升至現(xiàn)在的10%～15%。

本實驗室通過采集發(fā)病鴨的實質性器官，經病毒分離培養(yǎng)和分子生物學等方法，分離出1株未知病毒。經電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病毒粒子直徑為70～100 nm，有囊膜包裹。經核酸鑒定[3]，確定該病毒為1種新型的RNA病毒，并命名為鴨生長遲緩病毒（Duck growth retardation virus）Anhui2株[4-5]。

雖然該病毒不致死鴨子，但是能引起鴨子生長緩慢，殘次率升高，造成巨大的經濟損失。因此建立一種針對該新發(fā)疫病的快速檢測方法，確定其流行情況及病毒在宿主體內的分布情況，可為該疾病的預防控制提供理論參考和技術支持。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞株及血清 鴨生長遲緩病毒Anhui2株由本實驗室分離、保存[4]；小鼠骨髓瘤細胞株（SP2/0）由本實驗室保存；陰、陽性質控血清由本實驗室保存；鴨生長遲緩病毒Anhui2株陽性血清和陰性血清由本實驗室制備、保存。

1.2 實驗動物 6周齡和8～12周齡雌性BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.3 主要試劑 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和HRP標記的羊抗鼠IgG、PEG1500、HAT、HT購自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TMB顯色液購自武漢博士德公司。

1.4 病毒抗原的制備 將鴨生長遲緩病毒Anhui2株接種于9日齡SPF雞胚的尿囊腔中，棄去12 h內死亡的胚，并收集死亡雞胚的尿囊液，經0.2%甲醛滅活。將雞胚尿囊液在4℃下以8000×g離心30 min后，取上清經15 000×g高速離心1 h后，再取上清經170 000×g超速離心5 h后，沉淀用PBS（pH 7.4）溶解后，通過20%、40%、60%蔗糖梯度離心，收集40%～60%蔗糖層之間的白色條帶[6]，進行脫糖取沉淀，最后病毒沉淀用PBS懸浮，用作免疫抗原或包被抗原。

1.5 間接ELISA方法的建立 采用方陣滴定法[7]確定間接ELISA方法中包被抗原和陽性血清最佳濃度。將純化的鴨生長遲緩病毒Anhui2株抗原、鼠陽性血清和陰性血清分別作倍比稀釋，選擇OD450在1.0左右，且P/N值最大的抗原和血清濃度作為其最佳工作濃度[8-11]。

1.6 鴨生長遲緩病毒Anhui2株單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）的制備 參照參考文獻[12-13]方法，用純化的鴨生長遲緩病毒Anhui2株與等量弗氏完全佐劑乳化后，經腹部和背部皮下多點接種6周齡雌性BALB/c小鼠（200 μL/只）；每隔2周，用純化的病毒加入等量弗氏不完全佐劑乳化后，分別進行第2次和第3次免疫，免疫劑量和首免相同；3免2周后，皮下注射相同劑量的不加佐劑的Anhui2株病毒，進行加強免疫。當小鼠的抗體效價達到1∶104以上時，取抗體效價最高的小鼠脾臟用于細胞融合。

1.7 細胞融合和篩選 在加強免疫后d3，按常規(guī)淋巴細胞雜交瘤技術[14-15]將小鼠的脾細胞分離，使用50%PEG與SP2/0細胞融合。將融合的細胞接種在96孔板中，在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待雜交瘤細胞長至25%～75%時，采用間接ELISA檢測融合細胞分泌的McAb。雜交瘤細胞需要在96孔板中亞克隆3次。

1.8 單克隆抗體腹水的制備和效價測定 參照文獻[16-17]，取8～12周齡BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟。7～10 d后腹腔注入3×106個雜交瘤細胞，注射后7～10 d可見小鼠腹部明顯膨大。采取腹水，12 000×g離心10 min，收集上清液，采用1.5建立的ELISA方法檢測腹水的抗體效價，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 McAb中和活性的測定 通過病毒中和試驗檢測中和活性[18]。將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液和腹水經56℃滅活30 min，10倍稀釋后進行倍比稀釋，分別與含有100 ELD50的鴨生長遲緩病毒Anhui2株等體積混合，置37℃作用1 h，經尿囊腔接種9日齡雞胚；同時抗鴨生長遲緩病毒Anhui2株鼠陽性血清及SP2/0細胞培養(yǎng)上清分別作為陽性和陰性對照?？梢种?0%病毒增殖的抗體的最高稀釋倍數(shù)即為抗體中和效價。

1.10 阻斷ELISA方法的建立 抗原包被的濃度和McAb 1-5的最佳稀釋度通過棋盤滴定來確定。用400倍稀釋的純化病毒包被ELISA板，用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH9.6）4℃溫育過夜；用含有0.05%Tween-20、pH7.4的PBS洗滌抗原包被板，并用200 μL封閉緩沖液（含5%脫脂乳的PBS）37℃封閉1 h。血清樣品用PBS進行2倍、5倍、10倍、20倍稀釋，每塊板都設有陽性和陰性對照。每孔加入稀釋的血清樣品100 μL，37℃溫育1 h。用PBST洗滌3次，再與McAb 1-5在37℃溫育1 h。用PBST沖洗孔3次后，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG，在室溫下孵育1 h。用PBST沖洗3次，再加入100 μL TMB，并在室溫下溫育8 min。加入50 μL的2mol/L硫酸終止反應。阻斷率PI（%）=1 -測試血清的OD450/陰性對照血清的OD450×100%。利用316份未感染鴨生長遲緩病毒Anhui2株的鴨血清樣本，用于確定陽、陰性血清樣品的臨界值。臨界值確定為陰性血清PI的平均值+2倍或3倍標準偏差，確保95%或99%陰性血清樣品的PI值在該范圍內。

1.11 特異性試驗 采用1.10檢測方法依次對Ⅰ型鴨肝炎病毒（Duck Hepatitis virus type Ⅰ， DHAV-Ⅰ，編號N1）、Ⅲ型鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus type Ⅲ，DHAV-Ⅲ，編號N2）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV，編號N3）、鴨瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV，編號N4）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV，編號N5）、新型鴨細小病毒（Novel duck parvovirus，NDPV，編號N6）、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV，編號N7）、鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV，編號N8）陽性血清和4份鴨陰性質控血清（編號N9～N12）進行檢測，根據(jù)PI值確定其特異性。

1.12 敏感性試驗 將鴨生長遲緩病毒Anhui2株陽性血清倍比稀釋為1∶10～1∶1280，用1.10建立的方法進行檢測，根據(jù)實驗結果計算PI值確定其敏感性。

2 結果

2.1 細胞融合和雜交瘤細胞的建立 利用淋巴細胞雜交瘤細胞技術，通過間接ELISA方法對融合孔細胞進行篩選、鑒定和亞克隆純化，共獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗鴨生長遲緩病毒Anhui2株抗體的雜交瘤細胞，分別將其命名為1-5和3-6G。

2.2 雜交瘤細胞上清和腹水效價的測定 將陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水分別進行10倍系列稀釋，用1.5建立的間接ELISA方法測定OD450，同時設立鼠陽性和陰性血清對照。P/N值≥2.1時McAb的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。

表1 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水抗體效價Table1 Antibody titer of hybridoma cell supernatant and mice ascites

2.3 McAb中和活性的測定 中和試驗結果表明，獲得的兩株單抗均具有中和鴨生長遲緩病毒Anhui2株的活性。McAb 1-5細胞培養(yǎng)上清的中和抗體效價達1∶40，腹水中和抗體效價達1∶80。McAb 3-6G細胞培養(yǎng)上清和腹水的中和抗體效價均為1∶40。

2.4 阻斷ELISA反應條件的確定

2.4.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定將鴨生長遲緩病毒Anhui2株分別稀釋為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600進行包被，陽性血清與陰性血清分別稀釋為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20，進行阻斷ELISA試驗，各個稀釋度包被病毒與被檢血清的 OD450和阻斷率見表2。結果表明，病毒稀釋400倍，血清稀釋10倍作為被檢對象時，陽性血清和陰性血清的OD450都比較理想，阻斷率比較高。

表2 抗原和血清最佳稀釋度的篩選Table2 The best dilution of coating antigen and serum

2.4.2 待檢血清作用時間的確定 使用最佳條件包被和封閉ELISA板后，加入最佳稀釋濃度的陰、陽性血清，37℃分別作用1 h、1.5 h和2 h，對陰、陽性血清進行阻斷ELISA試驗，各個時間陰、陽性血清阻斷結果見表3。結果顯示，血清作用時間為1 h時，陽性血清的阻斷率最高，阻斷效果最好，所以選擇1 h為最佳血清作用時間。

表3 血清最佳作用時間Table 3 The optimal reaction time of serum

2.4.3 單克隆抗體工作濃度的確定 使用最佳條件包被和封閉ELISA板后，加入最佳稀釋度的陰、陽性血清，37℃分別作用1 h，將McAb 1-5稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80后進行阻斷ELISA試驗。結果顯示，McAb 1-5稀釋20倍時，阻斷效果最好（表4），所以選擇1∶20作為McAb最佳稀釋度。

表4 單克隆抗體（腹水）最佳稀釋度的篩選Table 4 The best dilution of McAb

2.5 阻斷ELISA判定標準的確定 對316份制備的陰性鴨血清樣品進行阻斷ELISA檢測，經統(tǒng)計學分析，計算出血清樣品的平均阻斷率（x）為1.9%，標準差（s）為8.0%，x+ 2s=17.9%，x+3s=26.0%；當PI≥26.0%時判定該血清為鴨生長遲緩病毒抗體陽性，PI≤17.9%時判定為該血清抗體陰性，17.9%＜PI＜26.0%時判為可疑，需重復檢測1次，如果仍低于26.0%則判定為血清抗體陰性。

2.6 特異性試驗 在特異性檢驗中，陰、陽性對照血清的檢測結果符合判定標準，檢測結果可信。12份特異性陰性質控血清的PI值均小于17.9%，判定為陰性（表5）。

表5 阻斷ELISA特異性試驗結果Table 5 Specificity test of blocking ELISA

2.7 敏感性試驗 將鴨生長遲緩病毒Anhui2株陽性血清進行倍比稀釋，用建立的阻斷ELISA方法進行檢測。結果顯示，血清稀釋40倍后仍檢測結果仍為陽性（PI值＞26.0%），而80倍稀釋的陽性血清檢測結果為陰性（PI值＜17.9%）（表6）。

表6 阻斷ELISA敏感性試驗結果Table 6 Sensitivity test of blocking ELISA

3 討論

鴨生長遲緩病毒在實驗條件下可造成鴨生長遲緩，體重下降，與發(fā)病鴨場出現(xiàn)的不同程度的生長遲緩相吻合。目前對該新發(fā)病的流行、傳播和病原分類均知之甚少，有效的血清學監(jiān)測對于監(jiān)測這種新出現(xiàn)的鴨病毒至關重要。本研究以Anhui2株全病毒作為抗原，篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗鴨生長遲緩病毒，具有較好的特異性和敏感性的單克隆抗體，為進一步研究該病毒致病機制奠定了基礎[19-21]。

在單克隆抗體的制備過程中，會影響細胞融合效果因素很多，其中最為重要的是SP2/0細胞的狀態(tài)。因此在融合前，應該先用 8-AG 處理細胞，使融合時的骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，有利于提高細胞融合的效率和成功率[14]。我們成功制備了抗鴨生長遲緩病毒Anhui2株的單克隆抗體，通過中和試驗表明該單抗具有中和活性，并在此基礎上建立了檢測鴨血清樣品中針對鴨生長遲緩病毒抗體的阻斷ELISA。本研究中固相載體上包被的是純化的滅活鴨生長遲緩病毒。加入待檢樣品中若無Anhui2株抗體，1-5則與固相載體上的鴨生長遲緩病毒結合，產生肉眼可見的顏色變化。如果樣品中含有鴨生長遲緩病毒，可與McAb 1-5結合后經洗滌除去，與固相載體上的鴨生長遲緩病毒結合的McAb 1-5量變小，則產生的顏色變淺。隨著樣品中鴨生長遲緩病毒量的增大，顏色就越淺，達到完全阻斷的含量后，則不能產生顏色變化。通過顏色變化可以定性，通過酶標儀讀數(shù)，則可以定量。

阻斷ELISA方法具有很多優(yōu)勢，能大量測試樣品并且適用多個物種，具有更高的靈敏度、特異性和便捷度，廣泛運用于動物傳染病的監(jiān)測和病毒抗體的臨床或實驗室檢測[9-11]。本研究建立的檢測鴨血清樣品中鴨生長遲緩病毒抗體的阻斷ELISA方法，具有良好的特異性和敏感性，對我國鴨生長遲緩病毒病的流行病學調查及診斷具有重要的意義。