超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中游離氨基酸成分

杜穎穎, 劉相真, 葉美君, 徐建峰, 高海燕, 鄭國建

(中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院, 國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 浙江 杭州 310016)

茶葉中的游離氨基酸是茶葉化學(xué)組分中的重要組成部分,也是茶葉品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)因子之一。大多數(shù)氨基酸都存在D型和L型兩種異構(gòu)體,其中L-氨基酸是人體重要營養(yǎng)物質(zhì)[1]。茶葉中含有20多種L型游離氨基酸,其組成和含量將直接影響茶葉的香氣和滋味。其中茶葉特有的氨基酸----茶氨酸具有類似味精的鮮爽和焦糖香氣[2],可緩解茶的苦澀味,增強(qiáng)其甜味[3],也是茶葉鮮爽滋味的主要來源,其他的氨基酸也具有各自的風(fēng)味特征。因此,茶葉中L型游離氨基酸組分分析對(duì)于茶葉品質(zhì)鑒定具有十分重要的意義。

對(duì)茶葉中游離氨基酸的檢測(cè)方法一直在摸索與精進(jìn)中。茚三酮比色法是目前測(cè)定游離氨基酸總量的常規(guī)方法,也是國標(biāo)《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》中所采用的檢測(cè)方法[4],但該法只適用于茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定,不能檢測(cè)茶葉中各游離氨基酸組分的含量。氨基酸自動(dòng)分析儀法應(yīng)用于茶葉中氨基酸的檢測(cè)已有多年歷史[5-8],但存在設(shè)備價(jià)格及儀器局限性等問題[9,10]。經(jīng)過多年發(fā)展,柱前衍生-高效液相色譜(HPLC)法已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步,其測(cè)定精密度和準(zhǔn)確性正向離子交換法逼近,加之HPLC具靈敏度高、儀器普及面廣、能一機(jī)多用等優(yōu)勢(shì),HPLC法測(cè)定茶葉中的氨基酸正式進(jìn)入廣泛應(yīng)用階段[11-13],但HPLC法的衍生化精確性及操作性等問題還有待更完善地解決[10,12]。因此,需尋求一種更準(zhǔn)確、高效、快速、操作簡便的方法來測(cè)定茶葉中的游離氨基酸。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)結(jié)合了液相色譜的強(qiáng)大分離功能和質(zhì)譜分析的高選擇性、高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性;樣品處理簡單,分析通量高,易于自動(dòng)化;分析復(fù)雜樣品時(shí)干擾小,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高,可信度高,特別適于低含量樣品的檢測(cè)分析。隨著串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)和電噴霧離子(ESI)源的快速發(fā)展,使得LC-MS/MS法成為氨基酸檢測(cè)的最熱門分析手段之一。目前此方法在測(cè)定植物[14-17]、動(dòng)物[18,19]體內(nèi)的游離氨基酸已見較多應(yīng)用,張磊等[20]應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)與LC-MS分析篩選出茶氨酸、谷氨酸及其他與茶葉滋味密切相關(guān)的化學(xué)成分,但還未見應(yīng)用LC-MS/MS法測(cè)定茶葉中各游離氨基酸組分的研究報(bào)道。

本文通過對(duì)質(zhì)譜、色譜條件和提取方法的優(yōu)化,在ESI源正離子掃描模式下檢測(cè),建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)直接測(cè)定茶葉中游離氨基酸的方法。采用該方法檢測(cè)了黃化品種綠茶(九凝飛黃)、白茶(白牡丹)和紅茶(英德紅茶)中游離氨基酸組分的含量,并與文獻(xiàn)中茚三酮法和HPLC法的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比和討論。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及設(shè)備

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); ACE EXCEL 2U AQ色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm,廣州菲羅門公司);分析天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);超純水系統(tǒng)(成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)。

1.2 試劑與材料

甲醇(色譜純,美國Tedia公司);乙酸銨(色譜純,美國Fluka公司);甲酸(色譜純,德國Merck公司)。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:L-天門冬氨酸(L-aspartic acid,簡寫為Asp,純度99%,低金屬含量)、L-脯氨酸(L-proline,簡寫為Pro,純度99%)、L-纈氨酸(L-valine,簡寫為Val,純度99%)、L-色氨酸(L-tryptophan,簡寫為Trp,純度99%)、L-異亮氨酸(L-isoleucine,簡寫為Ile,純度99%)、L-亮氨酸(L-leucine,簡寫為Leu,純度99%)、L-半胱氨酸(L-cysteine,簡寫為Cys,純度99%)、L-賴氨酸(L-lysine,簡寫為Lys,純度98%)、L-酪氨酸(L-tyrosine,簡寫為Tyr,純度99%)、L-谷氨酸(L-glutamic acid,簡寫為Glu,純度99%)、L-絲氨酸(L-serine,簡寫為Ser,純度99%)、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,簡寫為Phe,純度99%)、L-蛋氨酸(L-methionine,簡寫為Met, 99%)、甘氨酸(glycine,簡寫為Gly,純度99.5%)、L-丙氨酸(L-alanine,簡寫為Ala,純度99%)、L-天冬酰胺(L-asparagine,簡寫為Asn,純度99%)、L-谷氨酰胺(L-glutamine,簡寫為Gln,純度99%)、L-組氨酸(L-histidine,簡寫為His,純度98%)、L-精氨酸(L-arginine,簡寫為Arg,純度99%)、L-蘇氨酸(L-threonine,簡寫為Thr,純度99%)、L-茶氨酸(L-theanine,簡寫為Thea,純度99%)均購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。水為超純水。

選用九凝飛黃(浙江紫凝黃茶有限公司)、白牡丹(福建白天鵝茶業(yè)有限公司)和英德紅茶(英德英茶輝達(dá)電子商務(wù)有限公司),按照國標(biāo)[21]制備成磨碎樣品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氨基酸單體標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:分別稱取10.0 mg固體氨基酸單體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別用0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸水溶液溶解,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中避光保存。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:分別稱取除Gly外的18種氨基酸及2種酰胺類標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg,置于同一燒瓶,用0.2%甲酸水溶液溶解,配制成各氨基酸質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中避光保存。

1.4 氨基酸的提取條件

1.4.1提取溶劑

稱取5份試樣,每份取0.300 g,置于三角錐形瓶中,分別加入沸水、0.2%、0.4%、0.6%和1.0%甲酸水溶液各50 mL,在沸水浴中浸提45 min。稱取3份試樣,每份取0.300 g,置于三角錐形瓶中,分別加入0.2%甲酸水溶液、60%乙醇和85%乙醇各50 mL,在75 ℃水浴中浸提45 min。稱取1份試樣,每份取0.300 g,置于三角錐形瓶中,加入50 mL甲醇,在60 ℃水浴中浸提45 min。分別過濾并定容,過濾后的9份浸提液分別稀釋200倍,記為A1～A9;過濾后的9份浸提液分別稀釋600倍,記為B1～B9。將A1～A9和B1～B9分別用0.22 μm水相濾膜過濾,測(cè)定。

1.4.2提取茶水比

在1.4.1節(jié)的基礎(chǔ)上,選取最佳提取溶劑,分別按茶水質(zhì)量(g)體積(mL)比(簡稱茶水比)1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200的比例浸提45 min,分別過濾并定容,過濾后的浸提液分別稀釋200和600倍,再用0.22 μm水相濾膜過濾,測(cè)定。

1.4.3浸提時(shí)間

在1.4.1和1.4.2節(jié)的基礎(chǔ)上,選取最佳提取溶劑和茶水比,分別提取10、20、30、45和60 min,分別過濾并定容,過濾后的浸提液分別稀釋200倍和600倍,再用0.22 μm水相濾膜過濾,測(cè)定。

1.5 分析條件

1.5.1UHPLC條件

經(jīng)優(yōu)化后確定的條件為:ACE EXCEL 2U AQ色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm);流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸),流動(dòng)相B為甲醇;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5.0 μL。梯度洗脫條件:0～4.0 min, 100%A; 4.0～4.1 min, 100%A～100%B; 4.1～7.0 min, 100%B; 7.0～10.0 min, 100%B～100%A; 10.0～15.0 min, 100%A。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源為ESI,正離子模式;霧化氣為氮?dú)?離子噴霧電壓為3 500 V;霧化室溫度為120 ℃;離子源溫度為350 ℃;碰撞氣為氬氣,壓強(qiáng)為0.2 Pa;掃描模式為選擇反應(yīng)檢測(cè)(SRM)。

表 1 20種氨基酸質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 20種游離氨基酸的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatogram of the 20 free amino acids

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括選擇各氨基酸組分的子離子、去簇電壓、碰撞能量等。稀釋各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液至1 mg/L后,用針泵進(jìn)樣的方式,進(jìn)質(zhì)譜儀器直接分析,通過母離子掃描,調(diào)節(jié)碰撞能量,獲得穩(wěn)定性好、信號(hào)強(qiáng)度高的碎片離子。共優(yōu)化出除Gly之外的20種氨基酸參數(shù),結(jié)果見表1。將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),得提取離子流色譜圖(見圖1)。通過圖1可知,20種氨基酸可以通過母離子、子離子和保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化

由于各氨基酸的R基不同,各氨基酸在水中的溶解度不同,如Arg易溶于水,而Tyr幾乎不溶于水。根據(jù)氨基酸溶于酸的特性及前人的提取研究情況[22]。選取沸水、不同濃度甲酸的水溶液、60%乙醇、85%乙醇和100%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)各溶劑的沸點(diǎn),設(shè)定沸水浴、75 ℃水浴和65 ℃水浴。

圖 2 不同茶水比對(duì)游離氨基酸總量和主要氨基酸含量的影響Fig. 2 Effects of different tea-to-water ratios on the contents of total free amino acids and main amino acids

表 2 不同提取溶劑提取的游離氨基酸含量

ND: not detected.

從表2的結(jié)果可以看出,用不同的溶劑提取氨基酸,浸出氨基酸總量前3的溶劑順序?yàn)?0.2%甲酸(75 ℃水浴)>0.2%甲酸(100 ℃水浴)>0.4%甲酸。添加甲酸的水溶液浸提率要略高于沸水浸提,要明顯高于乙醇和甲醇溶液,浸出率最低的溶劑為100%甲醇,多個(gè)氨基酸組分未檢出。從表2中也可以看出,用0.2%甲酸(75 ℃水浴)浸提時(shí),主要氨基酸Thea、Arg、Asp浸出率也最高。因此,提取溶劑選擇0.2%甲酸(75 ℃水浴)。

2.2.2茶水比的優(yōu)化

按5個(gè)不同比例的茶水比,加入0.2%甲酸,在75 ℃水浴中浸提45 min。由圖2可知,茶水比對(duì)氨基酸提取影響也較為明顯,當(dāng)茶水比增加時(shí),測(cè)得的氨基酸總量隨之上升,茶水比在1∶100時(shí),氨基酸總量達(dá)到最高,隨后逐漸降低。Thea、Glu、Asp、Gln和Asn等主要氨基酸含量提取趨勢(shì)與總氨基酸含量相同。經(jīng)過分析,確定提取茶水比為1∶100。

2.2.3提取時(shí)間的優(yōu)化

確定提取溶劑為0.2%甲酸(75 ℃水浴)和茶水比為1∶100,在此基礎(chǔ)上,將磨碎試樣浸提10～60 min,共設(shè)5個(gè)參數(shù),結(jié)果見圖3。提取10 min時(shí),氨基酸溶出率已較高,氨基酸總量可溶出87.4%。在10～45 min期間,總氨基酸含量隨著提取時(shí)間增加而增加,在45 min時(shí)達(dá)到最高,隨后降低。Thea變化趨勢(shì)與氨基酸總量變化趨勢(shì)基本一致,在45 min時(shí)達(dá)到最高,而Arg、Glu、Gln也在45 min時(shí)溶出率最高,因此,選擇45 min為最終浸提時(shí)間。

圖 3 不同提取時(shí)間對(duì)氨基酸總量和主要氨基酸含量的影響Fig. 3 Effects of different extract times on contents oftotal free amino acids and main amino acids

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

將7個(gè)不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、250、500和1 000 μg/L)的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測(cè),用各氨基酸的峰面積對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(單位μg/L)進(jìn)行回歸分析,以3倍信噪比為檢出限(LOD),以10倍信噪比為定量限(LOQ)。由于茶葉中各氨基酸含量差異很大,Thea和Arg含量非常高。因此在測(cè)定茶樣時(shí),用稀釋600倍后的提取液測(cè)定Thea和Arg,稀釋200倍后的提取液測(cè)定其他氨基酸。根據(jù)稀釋后茶樣中各氨基酸的含量范圍,確定20種氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。由表3可知,在茶葉中各氨基酸的含量范圍內(nèi),各氨基酸的響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均可達(dá)0.99以上。LODs為0.001～0.011 mg/L, LOQs為0.010～0.053 mg/L。

2.3.2方法準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別稱取0.50 g茶葉樣品,加入適量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)各氨基酸定量限和茶葉中實(shí)際含有的各氨基酸濃度(Thea和Arg除外),配制成20和10 mg/L的添加水平。按照2.2節(jié)優(yōu)化的樣品提取方法進(jìn)行提取,稀釋200倍,相當(dāng)于最終檢測(cè)樣中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為100和50 μg/L。根據(jù)各氨基酸在茶樣中的含量水平,檢測(cè)并計(jì)算各氨基酸的回收率(Thea和Arg除外),結(jié)果見表4。分別稱取0.50 g茶葉樣品,加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成30 mg/L的添加水平,按照2.2節(jié)優(yōu)化的樣品提取方法,進(jìn)行提取,稀釋600倍,相當(dāng)于最終檢測(cè)樣中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為50 μg/L,檢測(cè)并計(jì)算Thea和Arg的回收率,結(jié)果見表4。由表4可知,樣品溶液中20種氨基酸的回收率為92.3%～109.2%,方法具有較高的準(zhǔn)確度。將10 μg/L的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次,其結(jié)果見表4,可知RSDs為2.00%～9.88%,方法具有較好的精密度。

表 3 氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

如表5所示,采用上述方法檢測(cè)黃化品種綠茶(九凝飛黃)、白茶(白牡丹)和紅茶(英德紅茶)中游離氨基酸組分的含量。數(shù)據(jù)顯示,在九凝飛黃中,Thea、Arg、Asp、Asn、Glu和Ser的含量要明顯高于白牡丹和英德紅茶,白牡丹中主要氨基酸Thea、Arg、Asp、Ser等含量要明顯高于英德紅茶,氨基酸總量為九凝飛黃>白牡丹>英德紅茶。之前的研究[23,24]表明,白化或黃化茶樹品種加工的茶葉與其他茶葉相比,會(huì)具有較高的氨基酸含量。用茚三酮比色法[4]測(cè)定九凝飛黃氨基酸總量為6.26%,除去兩個(gè)酰胺類物質(zhì)的含量,此法檢測(cè)的氨基酸總量略低于茚三酮比色法檢測(cè)結(jié)果。用高效液相色譜(HPLC)法[25]檢測(cè)九凝飛黃中的Thea,測(cè)得含量為2.26%。由表2可知,用沸水提取時(shí),九凝飛黃中Thea的檢測(cè)結(jié)果為2.240%,接近HPLC法檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)應(yīng)用此法中優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行檢測(cè)時(shí),九凝飛黃中Thea含量為2.347%,略高于上兩者,進(jìn)一步驗(yàn)證了此法的準(zhǔn)確性。

表 4 游離氨基酸在茶葉樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 5 不同種類茶中游離氨基酸含量

ND: not detected.

3 結(jié)論

本文通過對(duì)質(zhì)譜、色譜條件和茶葉中氨基酸提取方法的優(yōu)化,建立了UPLC-MS/MS直接測(cè)定茶葉中游離氨基酸的方法。與氨基酸自動(dòng)分析儀法和HPLC法相比,該方法操作簡單,不需要對(duì)茶樣進(jìn)行衍生化處理,分析時(shí)間短。該法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可有效檢測(cè)出茶葉中的20種氨基酸,可用于檢測(cè)茶葉中的游離氨基酸組分。