缺血性腦卒中患者不同時期腸道菌群的多樣性分析*

南 燕，李 哲，郭鋼花，丁巧方

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，鄭州 450052)

缺血性腦卒中(ischemic stroke)在所有腦卒中發(fā)病率、病死率、復發(fā)率最高[1-2]，是人類疾病防治的重點和難點。近來有研究表明，腸道菌群紊亂與缺血性腦卒中之間存在一定聯(lián)系，但具體機制仍不清楚[3-7]，且目前尚無對缺血性卒中不同時期腸道菌群的變化特點及其與腸道功能的相關(guān)研究。因此，本研究以缺血性卒中患者及健康對照者為研究對象，利用高通量測序平臺對二者糞便標本進行定性分析，以明確缺血性腦卒中患者不同時期腸道菌群的變化，進而為腦卒中治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年2月至2018年5月期間于本院神經(jīng)內(nèi)科就診的急性缺血性腦卒中患者15例(觀察組)。選擇同時期本院體檢中心的健康者20例作為對照組。(1)觀察組納入標準：①診斷標準參照1995年第四次全國腦血管疾病學術(shù)會議制訂的診斷標準，且經(jīng)頭顱 CT 、MRI或DWI等影像學檢查診斷明確；②自愿加入并配合該研究，簽署知情同意書；③年齡在40～70歲。(2)對照組納入標準：①無器質(zhì)性疾病及腦血管病相關(guān)病史，無家族史；②本研究所需的實驗室常規(guī)檢查(血、尿、糞便常規(guī)，肝腎功能、血脂)正常；③自愿加入并配合該研究，簽署知情同意書；④年齡在40～70歲。(3)觀察組排除標準：①既往或此次發(fā)病存在顱內(nèi)出血、惡性腫瘤、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)相關(guān)疾病、其他嚴重威脅生命的重大疾病(如肝衰竭、腎衰竭、心臟衰竭、呼吸衰竭等)；②3個月內(nèi)使用過任何抗生素、益生菌或益生元制劑。(4)對照組排除標準：除需滿足觀察組排除標準外，還需符合，①既往有腦血管疾病病史；②目前存在急性疾病或正在服用藥物。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者均接受神經(jīng)內(nèi)科常規(guī)治療，包括營養(yǎng)神經(jīng)、活血化淤、改善微循環(huán)、降壓降糖等藥物治療；所有患者均為低鹽低脂飲食。

1.2.2標本采集 使用專用的糞便收集盒、糞菌DNA保存液收集、保存所有入選者的糞便標本，以盡量減少標本污染和DNA降解等。所有糞便樣本均及時凍存于-80 ℃冰箱中儲存。

1.2.3腸道菌群DNA提取、PCR擴增及基因測序 觀察組和對照組的所有糞便標本均統(tǒng)一進行腸道菌群DNA提取、PCR擴增及利用Illumina MiSeq測序平臺進行基因測序。

1.2.4生物學分析

1.2.4.1操作分類單元(OTUs) 獲取及分類學分析 在97%相似度下利用Usearch算法，通過聚類操作，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs的代表序列，然后將所有優(yōu)化序列比對至OTUs代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，獲得最終的OTUs代表序列。采用RDP classifier貝葉斯算法對最終OTUs代表序列在門、綱、目、科、屬和種等各個分類水平進行分析，獲得各標本的群落組成情況。對比數(shù)據(jù)庫為Greengene(Release 13.5 http://greengenes.secondgenome.com/)。

1.2.4.2物種多樣性分析 a-多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，本研究選擇最能反映物種豐富度和均勻度的香農(nóng)指數(shù)(shannon指數(shù))和辛普森指數(shù)(simpson指數(shù))進行分析，然后通過Wilcoxon秩和檢驗進行指數(shù)組間差異檢驗。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。shannon指數(shù)越高說明樣品中的物種越豐富；simpson指數(shù)越低，說明樣品中的物種越豐富。

1.2.4.3物種差異分析 利用線性判別分析(LEfSe分析)進行多級物種差異判別分析，LEfSe一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標識和揭示基因組特征的軟件。包括基因，代謝和分類，用于區(qū)別兩個或兩個以上生物條件(或者是類群)。

2 結(jié) 果

2.1兩組對象基線資料比較 觀察組中15例患者均提供了急性期的首個糞便標本，因2例患者拒絕再次提供樣本，故有13例患者提供了恢復期的首個糞便標本，對照組中20例入選者均提供了體檢當天的糞便標本。觀察組患者和對照組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等相關(guān)指標比較，見表1。

表1 兩組對象基本信息比較

2.2觀察組患者不同時期與對照組的腸道菌群多樣性比較 觀察組患者在急性期及恢復期的腸道菌群多樣性較對照組均出現(xiàn)明顯減少(P<0.05)，且觀察恢復期較急性期腸道菌群多樣性增加(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與急性期比較；b：P<0.05，與恢復期比較

圖1觀察患者不同時期與對照組腸道菌群多樣性變化比較

2.3觀察組患者不同時期與對照組LEfSe多級物種差異判別分析 觀察組患者在急性期、恢復期與對照組在門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)等不同分類學水平的LEfSe多級物種差異判別分析見圖2、3。對照組的特征性菌群為擬桿菌類(Bacteroides)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)；觀察組患者急性期的特征性菌群為普羅威登斯菌屬(Providencia)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)，恢復期的特征性菌群為Providencia、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)。

圖3 觀察組患者恢復期與對照組不同分類學水平LEfSe分析

2.4觀察組患者不同時期物種組成差異分析 觀察組患者急性期與恢復期的物種組成差異分析見圖4。采用Wilcoxon秩和檢驗，在屬水平上未發(fā)現(xiàn)觀察組患者急性期與恢復期之間存在明顯統(tǒng)計學差異的物種。

圖4 觀察組患者不同時期物種組成差異分析

3 討 論

近年來，隨著微生物組學的發(fā)展，腸道菌群與多種疾病之間的關(guān)系成為近年來的研究熱點[8-10]。諸多研究表明腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、帕金森病等之間存在關(guān)系[11]。腦卒中患者及腦卒中后抑郁患者的腸道菌群多樣性及物種組成等方面均會發(fā)生變化。

3.1腦卒中對腸道菌群多樣性及物種組成的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患者中Faecalibacterium下降，Providencia、Oscillibacter、Ruminococcaceae增加。Faecalibacterium是一種可以產(chǎn)丁酸鹽的抗炎性細菌，該菌在2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、卒中后抑郁等疾病中有下降的現(xiàn)象[12-14]。Providencia可引起消化道感染、泌尿道感染及其他腸道外感染，是引起醫(yī)院感染的常見機會性致病菌，也是常見的耐藥菌。缺血性腦卒中后增加的Ruminococcaceae可以使皮質(zhì)醇增高，5-羥色胺表達上調(diào)，進而加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，有研究對腸道菌群的基因組學組成研究亦發(fā)現(xiàn)腦缺血患者的Ruminococcaceae明顯增加[15]。Oscillibacter在卒中后抑郁患者中減少，同時該菌還與氧化三甲胺(TMAO)水平呈正相關(guān)[14，16]?？傮w來說，腦卒中發(fā)生后，腸道內(nèi)部分有益菌減少，部分機會性致病菌增多，且會持續(xù)相當一段時間，神經(jīng)系統(tǒng)損傷、卒中后抑郁、機會性致病菌感染可能與此有關(guān)。

3.2缺血性腦卒中不同時期的腸道菌群變化特點 缺血性腦卒中急性期與恢復期的腸道菌群在物種組成上雖無明顯統(tǒng)計學差異，但通過多樣性分析發(fā)現(xiàn)后者較前者的腸道菌群多樣性有增加的趨勢，這在一定程度上可以反映出缺血性腦卒中患者腸道功能在恢復。因此，本課題組推測隨著各項綜合治療的進行及病程的自然進展，在患者的臨床癥狀、功能障礙逐漸好轉(zhuǎn)的情況下，患者的腸道菌群多樣性、物種組成及腸道功能有恢復的可能性，但腸道菌群的恢復時間、程度及與患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)之間的相關(guān)性等仍有待進一步研究。

缺血性腦卒中不同時期出現(xiàn)的腸道菌群變化可能是腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。近年來，新提出的“菌群-腸-腦”軸概念是研究卒中與腸道菌群關(guān)系的前提假設[17]，目前認為腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、迷走神經(jīng)3條途徑相互作用[18-20]，這3種途徑之間相互影響，相互作用，實現(xiàn)腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交流。此外，腸道菌群還可直接或間接影響高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等腦卒中危險因素，從而對腦卒中的發(fā)生及預后產(chǎn)生影響[21-22]。PONFERRADA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血作為一種應激，可導致細菌移位，同時，細菌移位會增加梗死面積，給卒中結(jié)局帶來不良影響[24]，此外有研究表明糞菌移植可以明顯改善卒中預后[25]，這些研究都說明缺血性腦卒中與腸道菌群之間存在相互影響。

通過本研究推測，正是由于上述復雜的作用機制，才形成了缺血性腦卒中不同時期腸道菌群的變化特點。隨著缺血性腦卒中臨床癥狀的好轉(zhuǎn)及梗死灶的軟化，腸道菌群亦有恢復的可能性，二者之間相輔相成，互相影響，這也印證了“菌群-腸-腦”軸存在的可能性。

本研究仍存在一些不足，未能對缺血性腦卒中更遠期與腸道菌群的關(guān)系進行研究，需擴大樣本量、延長觀察時間，希望能夠找出腦卒中時期具有代表性的腸道菌群，進而更具針對性的補充益生菌，為腦卒中的治療提供新的靶點。