ELP2/STAT3/SETD2基因組拷貝數(shù)變異與胃癌化療反應的相關性研究*

劉瓊茹，黃秀芳，梁津杰，方曉華，蔡育波，楊文麗，黃 輝，陳艷虹，陳仙蘭，張 鑫,2，林碧華

(1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科 529030；2.廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東東莞 523808)

胃癌(gastric carcinoma)是常見的消化道惡性腫瘤，其中胃腺癌最為常見，可占85%以上。我國的胃癌發(fā)病率一直較高，從2004年后便居于發(fā)病癌譜的第二位[1]。2015年我國新發(fā)胃癌患者估算為67.9萬，其中男性47.8萬、女性20.1萬，同期因胃癌死亡的患者約為49.8萬，其中男性33.9萬、女性15.9萬[2]。相比之下，2012年世界范圍內新發(fā)胃癌病例約95.1萬，其中男性63.1萬、女性32.0萬；同期因胃癌致死患者約72.3萬，其中男性46.9萬、女性25.4萬[3]。粗略統(tǒng)計可知世界新發(fā)胃癌的患者，一半以上位于我國，較為精確的流行病學研究顯示，包括我國在內的東亞地區(qū)是胃癌的第一高發(fā)區(qū),發(fā)病率約為24.6/10萬人，其男性約35.4/10萬人，女性約13.8/10萬人，遠高于世界平均發(fā)病率的7.5/10萬人，其中男性約9.8/10萬人、女性約5.1/10萬人[3]。可見我國胃癌防治的嚴峻，因此更應深入研究胃癌的發(fā)病相關機制，尋找更為有效的診斷標記物及潛在的治療靶點。

由于早期癥狀不典型，普查不及時，目前在我國早期胃癌的診斷率不足10%，有65%～70%的胃癌患者在就診時已經達到中晚期，5年生存率較低，僅為27.4%，因此化療和靶向治療在胃癌治療中起關鍵作用[4]。臨床中胃癌除了診斷和鑒別診斷相關的免疫標志物外，還有如人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和MET原癌基因受體(MET proto-oncogene-receptor tyrosine kinase,MET)等治療靶點相關標志物；雖然與胃癌患者化療及預后相關的標志物有Ki-67、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、切除修復交叉互補基因(excision repair cross-complementing 1,ERCC1)等，但缺少統(tǒng)一的判讀標準，且局限于蛋白表達水平[5]。因此，本課題組將嘗試利用全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNV)分析的方法，在癌癥基因組圖譜計劃數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)中嘗試鑒別出于胃癌患者化療抵抗相關的基因。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集整理2008年1月到2013年12月在江門市中心醫(yī)院就診的胃癌患者信息，納入標準：(1)有手術標本，采用改良的D2根治術；(2)有術后化療記錄，化療周期不超過6個月；(3)有2年定期隨訪檢查記錄，能明確判斷復發(fā)進展狀況。共納入64例胃癌患者，其中21例患者2年內的隨訪檢查有復發(fā)進展狀況，其余43例患者2年內無復發(fā)進展事件。TCGA與江門市中心醫(yī)院胃癌患者的一般信息，見表1。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息[n(%)]

1.2方法

1.2.1TCGA胃癌的全基因組CNV分析 參照文獻[6]報道，利用開放軟件TCGA簡易下載工具V9.2(http://www.shengxin.ren/article/95)，下載TCGA中胃癌的基因組拷貝信息及對應樣品的臨床信息，數(shù)據(jù)庫的更新下載日期為2018年5月31日，其中總病例數(shù)為443例，具有詳細化療藥物使用信息的有135例，具有詳細化療藥物使用信息和全基因拷貝信息的有121例，具有生存預后信息及全基因拷貝信息的有441例。參考文獻[6-9]報道，在GenePattern公共服務器平臺(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0軟件分析全基因組拷貝信息。

1.2.2熒光定量PCR檢測石蠟標本的基因組CNV 調取患者手術標本中腫瘤成分70%的石蠟組織，10 μm厚度切片4張。利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs00585301_cn、Hs02658328_cn和Hs02774936_cn別檢測ELP2、STAT3和SETD2基因組拷貝數(shù)，其中內參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測。參照文獻[10]標準，規(guī)定樣品中目標基因的相對拷貝數(shù)檢測值小于0.75為缺失(Deletion)，>1.50為擴增(Gain)，其余為二倍體(Diploid)。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Excel2010及GraphPadPrism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用頻數(shù)表示，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用χ2檢驗或Fisher′s精確檢驗，生存分析使用Kaplan-Meier分析方法及l(fā)og-rank檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌化療用藥情況分析 通過分析TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的臨床用藥信息，分別得到135例及64例患者記錄了詳細的化療藥物使用信息，其所用藥物及分布，見表2，從表中數(shù)據(jù)可知氟尿嘧啶+鉑類是胃癌患者最常用的化療方案。在TCGA數(shù)據(jù)庫的135例患者中，有81例治療后呈完全緩解(complete response,CR)，3例為部分緩解(partial response,PR)，10例為病情穩(wěn)定(stable disease,SD)，41例為病情進展(progressive disease,PD)。將呈CR的患者定義為化療敏感(chemotherapy sensitivity,CS)，而PD的患者定義為化療抵抗(chemotherapy resistant,CR)。在該院64例患者中，將21例患者2年內的隨訪檢查有復發(fā)進展狀況定義為CR，其余43例患者2年內無復發(fā)進展事件定義為CS。

2.2TCGA胃癌化療反應相關的全基因組拷貝數(shù)分析 GISTIC 2.0分析顯示，18q12.2和17q21.2區(qū)段特異性在化療抵抗患者腫瘤組織中擴增，3p21.31區(qū)段特異性在化療抵抗患者腫瘤組織中缺失，見圖1、2。

表2 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌化療用藥情況

圖2 胃癌腫瘤組織中全基因組缺失情況

2.3TCGA數(shù)據(jù)庫中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與化療反應相關性 利用GISTIC 2.0軟件明確18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因組CNV熱點基因分別為乙?；D移酶延伸因子復合物亞基2(elongator acetyltransferase complex subunit 2,ELP2)、信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和組蛋白甲基轉移酶SETD2(histone-lysine n-methyltransferase 2,SETD2)；結果顯示，ELP2和STAT3的擴增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗相關(P<0.05)。綜合3個基因的CNV情況，可知CR患者中有其中1個指標陽性為24例，3個指標均陰性為17例；CS患者中，有其中1個指標陽性為17例，3個指標均陰性為63例，兩組患者3個基因的分布比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫中患者ELP2/STAT3/SETD2的基因拷貝數(shù)情況與化療反應間相關性分析[n(%)]

表4 江門市中心醫(yī)院患者ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)與化療反應間相關性分析[n(%)]

2.4TCGA數(shù)據(jù)庫中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與患者預后相關性 利用TCGA數(shù)據(jù)庫中患者的預后情況，以ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)作為分組，將患者分為3個指標任意1個指標陽性組(P組)及陰性組(N組)。陽性組患者的總生存時間(OS)、無進展生存時間(RFS)均明顯短于陰性組(21.7、14.2個月vs. 34.8、17.9個月)，且兩組患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：胃癌患者OS曲線；B：胃癌患者RFS曲線

圖3 TCGA胃癌患者生存預后情況

2.5江門市中心醫(yī)院患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與化療反應相關性 利用熒光定量PCR技術，檢測64例患者腫瘤組織中ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)。結果顯示，ELP2和STAT3的擴增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗相關(P<0.05)。綜合3個基因的CNV情況，CR患者中1個指標陽性為14例，3個指標均陰性為7例；CS患者中1個指標陽性為9例，3個指標均陰性為34例，兩組患者3個基因的分布比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

3 討 論

本研究利用基因組CNV分析的方法，發(fā)現(xiàn)18q12.2區(qū)段、17q21.2區(qū)段在TCGA化療抵抗樣品中特異性擴增而3p21.31區(qū)段則缺失，并明確18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因組CNV熱點基因分別為ELP2、STAT3和SETD2，進一步利用江門市中心醫(yī)院的胃癌臨床標本進行驗證，明確了ELP2和STAT3的擴增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗明顯相關(P<0.05)。

組蛋白修飾調控因子(如乙?；腿ヒ阴；?，甲基化和去甲基化酶等)是表觀遺傳調控的重要組成，其異常激活或失活經常導致人類的各種疾病尤其是癌癥的發(fā)生。ELP2是延伸體(elongator)復合物的主要亞基，延伸體具有組蛋白乙酰轉移酶活性，廣泛參與了RNA聚合酶Ⅱ介導的轉錄延伸、RNA修飾、細胞分裂、細胞骨架構建等細胞內關鍵調控過程，在真核生物中高度保守。有研究發(fā)現(xiàn)，ELP2具有兩個七葉的含WD40結構域的 螺旋槳結構，并通過WD40折疊的完整性與ELP1和ELP3亞基結合，實現(xiàn)延伸體的裝配，此外ELP2發(fā)生突變會明顯影響延伸體的組蛋白H3乙?；钚訹11]，表明ELP2是延伸體行使功能的必要組分，也是復合體形成的樞紐。

雖然ELP2在癌癥中的研究較少，但有研究發(fā)現(xiàn)，ELP2與STAT3有相互作用，參與了STAT3的轉錄調控及STAT3信號通路的轉導[12]，而本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的擴增與胃癌的化療抵抗明顯相關(P<0.05)。國外有研究已經明確STAT3的激活在胃癌發(fā)生、發(fā)展中密切相關，抑制STAT3能增加化療藥物對胃癌細胞的殺傷[13]。雖然激活STAT3的信號通路很多，但是利用免疫組織化學檢測判斷STAT3激活狀態(tài)的標準難以統(tǒng)一，而本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌化療的患者腫瘤組織中，ELP2和STAT3在基因組水平就存在拷貝數(shù)擴增的情況。相比免疫組織化學評價STAT3的激活情況，利用原位雜交或PCR技術則更容易實踐及統(tǒng)一標準，相關的研究會是本課題后續(xù)努力的方向。

除了ELP2介導的組蛋白H3乙?；M蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)還能夠被多種甲基化酶修飾，其中SETD2能夠在H3K36位點上產生三甲基化修飾(H3K36me3)，在轉錄延伸，RNA剪接和DNA損傷修復等過程中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用[14]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SETD2在結直腸癌[14]、胃腸道間質瘤[15]、透明細胞腎癌[16]等多種惡性腫瘤中起抑癌作用，而SETD2缺失可能通過改變極性蛋白2(dishevelled segment polarity protein 2,DVL2)轉錄時的內含子剪切過程，引起DVL2的mRNA降解，激活Wnt信號通路，促進了結直腸癌的癌變過程[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中SETD2的表達下調，且SETD2的低表達與患者差的預后相關，過表達SETD2能抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲[17]，表明SETD2在胃癌中也是重要的抑癌基因。

雖然未見SETD2與ELP2及STAT3相互作用的報道，但是SETD2與ELP2同樣屬于組蛋白修飾調控因子，SETD2起甲基化修飾，而ELP2起乙?；揎?。在基因轉錄的過程中，組蛋白的H3K36去甲基化及H3K27乙?；男揎棧寝D錄啟動的特征標志[18]，是否SETD2的缺失及ELP2的擴增對STAT3啟動靶基因的轉錄調控起協(xié)調作用，這值得本課題組進一步探索。