基于磁性納米富集DNA及滾環(huán)擴增技術(shù)檢測PBMC內(nèi)HBV cccDNA臨床價值分析*

王友強，郭永燦，蘭由玉，魏 聰，劉 鵬

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝病科，四川瀘州 646000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈全球流行性趨勢，據(jù)統(tǒng)計全世界范圍內(nèi)有近20億人曾經(jīng)感染HBV，慢性HBV攜帶者超過2.5億[1]。我國是HBV感染最高發(fā)國家，目前有超過9 000萬慢性HBV攜帶者，乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)相關(guān)肝硬化、肝癌更是其死亡主要因素[2]。共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)通過HBV病毒復(fù)制進入宿主細(xì)胞核，HBV cccDNA水平較低，但卻是HBV復(fù)制不可缺少的關(guān)鍵分子：它是HBV前基因組及RNA轉(zhuǎn)錄的原始模板[3]，可影響HBV對宿主的感染狀態(tài)，而清除細(xì)胞核HBV cccDNA是治愈HBV感染的標(biāo)志。HBV主要在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但對肝細(xì)胞之外的其他細(xì)胞也具有泛嗜性，單個核細(xì)胞是可以被HBV感染的免疫活細(xì)胞，有研究顯示在外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中能檢測出HBV DNA及HBV cccDNA[4]。但是細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA含量低，要獲取高純度HBV cccDNA難度較大，本研究通過磁性納米富集技術(shù)及滾環(huán)擴增(rolling circle amplication，RCA)技術(shù)測定HBV cccDNA水平，以期構(gòu)建HBV cccDNA高靈敏度檢測方法，并探討檢測PBMC中HBV cccDNA臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2016年1月至2018年1月收治的HBV感染者98例為HBV組，其中男62例，女36例，年齡(39.51±7.22)歲，急性HBV感染8例，慢性HBV感染59例，肝硬化23例，肝衰竭8例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有納入病例均符合《病毒性肝炎防治方案》[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期婦女；(2)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者；(3)甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒感染者；(4)需要抗病毒治療患者曾經(jīng)使用阿德福韋酯片或恩替卡韋片治療無效者。同時選擇該院100例健康體檢者為對照組。所有納入研究者均知曉本研究目的、過程及意義，簽署知情同意書。本研究得到醫(yī)院倫理委員會支持。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 血液標(biāo)本：取患者空腹靜脈血肝素抗凝、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝各5 mL，肝素抗凝血3 500 r/min離心5 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱，待測乙肝兩對半、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。EDTA抗凝血用于提取PBMC。肝組織活檢：患者行B超引導(dǎo)下肝穿刺取活檢組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片等程序后以蘇木素-伊紅(HE)染色，由有經(jīng)驗的病理學(xué)醫(yī)師獨立完成病理分級。

1.2.2HBV感染標(biāo)志物測定 實時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀，Thermo公司，美國)，用全自動化學(xué)發(fā)光儀測定血清HBsAg、HBeAg水平(雅培I-2000)。均采用配套成品試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3HBV cccDNA測定

1.2.3.1PBMC提取 采用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心提取PBMC，完成后以0.9%生理鹽水洗滌3次，留細(xì)胞沉淀，保存于-20 ℃冰箱待測。

1.2.3.2HBV cccDNA提取 首先構(gòu)建針對HBV cccDNA的特異性探針磁性納米微球：(1)20 mL氯化鐵(FeCl3，1.0 mol/L)與5 mL氯化亞鐵(FeCl2，2.0 mol/L)溶液混合均勻加入到250 mL(0.7 mol/L) 的氨水溶液中，離心分離后所得的黑褐色沉淀以超純水洗至中性，干燥后得到磁性氯化鐵(Fe3O4)納米粒子；(2)以1∶1∶4比例均勻混合Triton X-100、正己醇和環(huán)己烷，加入前述方法制訂Fe3O4納米分子，及正硅酸乙酯、氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%～30%)，持續(xù)攪拌24 h后用丙酮破壞乳化，并在一定的外磁場下收集顆粒，即為硅殼磁性納米顆粒；(3)將鏈霉親和素溶液(2.5 mg/mL)加入到5 mg前述方法制訂的硅殼磁性納米顆粒中，在4 ℃下恒溫振蕩培育24 h，PBS緩沖液洗滌3次，用2%的戊二醛溶液固定納米顆粒表面的鏈霉親和素，再將生物素標(biāo)記的針對HBV cccDNA特異序列探針通過與修飾在硅殼磁納米顆粒表面的親和素偶聯(lián)，即HBV cccDNA磁性納米顆粒。以基因組提取試劑盒(Thermo，美國)提取總PBMC內(nèi)總DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，分光光度儀260/280吸光度值在1.6～2.0為合格DNA標(biāo)本，將得到的總DNA用PSAD酶(Plasmid-SafeTMATP-Dependent DNase)酶切消化以除去非cccDNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠脴?gòu)建成功HBV cccDNA功能化納米顆粒富集、分離HBV cccDNA，詳細(xì)操作參照文獻[6]。

1.2.3.3HBV cccDNA檢測 RCA：以HBV高度保守區(qū)域分別設(shè)計8條與HBV cccDNA正鏈、負(fù)鏈互補的引物(上海生工)，序列見表1。RCA反應(yīng)體系：10×Phi29 DNA聚合酶Buffer 1 μL、引物(R1-R81) 4 μL、DNA 4 μL、ddH2O補足1 μL，總體積：10 μL，經(jīng)95 ℃ 3 min、50 ℃ 15 s、30 ℃ 15 s、20 ℃ 10 min反應(yīng)后，再向混合液加入Phi29 DNA聚合酶1 μL(10 U/μL)、10×Phi29 DNA聚合酶Buffer 1 μL、引物(R1-R81) 4 μL、BSA 1 μL(0.4 mg/mL)、4×dNTP混合物3 μL，總體積：20 μL，30 ℃水浴16 h，65 ℃水浴10 min，保留RCA產(chǎn)物。以RCA產(chǎn)物為模板，進行跨缺口引物介導(dǎo)的實時熒光定量PCR反應(yīng)，引物Prime1：5′-GGG GCG CAC CTC TCT TTA-3′，Prime2：5′-AGG CAC AGC TTG GAG GC-3′，具體操作參照文獻[7]。

1.2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線 選擇1×104、1×105、1×106、1×107copies/mL濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷該方法敏感性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分布檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。非正態(tài)分布計數(shù)資料以中位數(shù)描述，采用Wilcoxon符號秩和檢驗。HBV cccDNA與感染指標(biāo)采用Spearman秩相關(guān)性分析。采用受試者工作特征曲線(ROC)分析HBV cccDNA對抗病毒治療效果進行預(yù)測。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1方法學(xué)分析 采用1×104、1×105、1×106、1×107copies/mL濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示：擴增曲線平行性好、濃度梯度拐點明顯、無交叉現(xiàn)象，曲線斜率穩(wěn)定，敏感性較高?；颊逪BV cccDNA擴增曲線顯示：陽性標(biāo)本、陰性標(biāo)本曲線清晰，均為典型擴增曲線，無非特異性擴增曲線，不同濃度階段曲線分界清楚，見圖1。

2.2HBV cccDNA陽性率 98例HBV感染患者中HBV cccDNA陽性61例(62.24%)，對照組中HBV cccDNA陽性0例。HBV感染不同病情階段HBV cccDNA陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)，HBV感染伴肝衰竭、HBV感染伴肝硬化患者HBV cccDNA陽性率明顯高于急性HBV、慢性HBV感染，其中HBV感染伴肝衰竭陽性率最高，達到100%(P<0.05)；急性HBV、慢性HBV感染間HBV cccDNA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

*：堿基硫化

A：標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線；B：標(biāo)準(zhǔn)品斜率；C：標(biāo)本擴增曲線

圖1擴增曲線

2.3不同病理分期及HBV DNA水平患者HBV cccDNA水平比較 經(jīng)病理活檢進行組織炎癥活動度分級、纖維化分期，34例患者分期小于G2/S2期，64例患者分期在G2/S2或以上，≥G2/S2期患者HBV cccDNA水平(中位數(shù)：5.8 lg copies/mL)明顯高于小于G2/S2期患者(中位數(shù)：3.7 lg copies/mL)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.378，P=0.001)。將HBV患者按照HBV DNA水平進行分組，≥1×105copies/mL患者HBV cccDNA水平(中位數(shù)：6.2 lg copies/mL)明顯高于小于1×105copies/mL患者(中位數(shù)：4.1 lg copies/mL)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.102，P=0.001)，見圖2。

表2 不同HBV感染階段HBV cccDNA陽性率比較[n(%)]

a：P<0.05，與急性HBV比較；b：P<0.05,與慢性HBV比較

2.4HBV cccDNA與感染指標(biāo)相關(guān)性分析 HBV患者PBMC內(nèi)HBV cccDNA水平與血清HBV DNA呈明顯正相關(guān)性(r=0.437，P=0.000)，見圖3A。HBV cccDNA與血清感染性指標(biāo)相關(guān)性分析顯示，PBMC內(nèi)HBV cccDNA水平與HBsAg呈明顯正相關(guān)性(r=0.338，P=0.001)，見圖3B；98例患者中有35例患者HBeAg陽性，HBeAg陽性患者PBMC內(nèi)HBV cccDNA水平與HBeAg水平呈明顯正相關(guān)性(r=0.521，P=0.001)，見圖3C。

圖2 不同病理分期及HBV DNA水平患者

圖3 PBMC內(nèi)HBV cccDNA與感染指標(biāo)相關(guān)性分析

圖4 PBMC內(nèi)HBV cccDNA對抗病毒治療效果ROC曲線

2.5PBMC內(nèi)HBV cccDNA對抗病毒治療效果ROC曲線分析 共有40例患者需要抗病毒治療，以HBV患者抗病毒治療后出現(xiàn)病毒應(yīng)答為標(biāo)準(zhǔn)，分析HBV cccDNA對抗病毒治療效果判斷價值。在抗病毒治療12周時PBMC內(nèi)HBV cccDNA量對病毒應(yīng)答無明顯預(yù)測作用，ROC曲線下面積(AUC)為0.608(95%CI：0.415～0.800)，P=0.268。在抗病毒治療24、48周時PBMC內(nèi)HBV cccDNA量可對病毒應(yīng)答明顯預(yù)測，AUC分別為0.771(95%CI：0.625～0.917)，P=0.005，0.868(95%CI：0.767～0.969)，P=0.000。ROC分析提示，在治療48周時HBV cccDNA為3.2 lg copies/mL時可作為預(yù)測出現(xiàn)病毒應(yīng)答效應(yīng)的截斷面，約登指數(shù)達到最大，見圖4。

3 討 論

HBV cccDNA無論在肝臟組織或其他感染細(xì)胞內(nèi)均以較低水平存在，但是其可通過HBV前基因組及RNA轉(zhuǎn)錄來調(diào)控HBV病毒在宿主內(nèi)復(fù)制。HBV cccDNA的清除預(yù)示著病毒在體內(nèi)生命周期終結(jié)，有研究認(rèn)為清除細(xì)胞核HBV cccDNA是治愈HBV感染的標(biāo)志[3]。在HBV感染、病情監(jiān)測及治療相關(guān)指標(biāo)中，單純檢測HBV DNA對臨床分析具有局限性，而HBV cccDNA水平測定可彌補不足，二者綜合分析會更真實反映宿主體內(nèi)HBV復(fù)制及感染狀態(tài)，能夠為臨床提供可靠的治療依據(jù)[8]。PBMC是免疫活細(xì)胞，HBV患者出現(xiàn)免疫抵抗能力下降可能與病毒在PBMC內(nèi)長期復(fù)制而導(dǎo)致的免疫功能紊亂有關(guān)[9]。HBV持續(xù)慢性感染PBMC可能參與母嬰垂直傳播、肝移植后HBV復(fù)發(fā)等[10]。PBMC內(nèi)HBV cccDNA水平與宿主肝臟組織HBV感染、復(fù)制情況具有一致性[11]，但HBV cccDNA在PBMC內(nèi)水平較低，受限于檢測方法的靈敏度與特異度，目前尚不能作臨床常規(guī)檢測。

國內(nèi)外學(xué)者已建立多種HBV cccDNA檢測方法，由于細(xì)胞內(nèi)水平低難以獲得高純度cccDNA，以及與cccDNA具有同源序列的雙鏈DNA(rcDNA)干擾，這些檢測方法都難以獲得理想的靈敏度[12]。磁性納米富集技術(shù)利用磁性微粒表面功能化基團特異親和功能，可特異性地實現(xiàn)互補目標(biāo)單鏈核苷酸片段的高效快速富集分離，本課題組在前期已經(jīng)完成該方法特異性納米顆粒的制備，其性能得到驗證[7]。RCA具有很強擴增能力，在單核苷酸多態(tài)性、細(xì)胞原位分析等微量核酸測定有廣泛應(yīng)用[13]，與傳統(tǒng)PCR比較，RCA只能在特異性聚合酶作用下擴增環(huán)狀DNA模板，可有效避免rcDNA對cccDNA擴增的影響。本研究選擇磁性納米富集聯(lián)合RCA技術(shù)來測定PBMC內(nèi)HBV cccDNA，其擴增曲線清晰、典型，具有穩(wěn)定的斜率、平行性。

本研究納入98例HBV感染患者，HBV cccDNA陽性率隨著病情進展其陽性率也隨之增加，肝硬化、肝衰竭患者PBMC內(nèi)HBV cccDNA陽性率明顯升高(P<0.05)。而高HBV DNA載量患者PBMC內(nèi)HBV cccDNA拷貝數(shù)明顯高于低HBV DNA載量患者，HBV DNA也與HBV cccDNA呈明顯正相關(guān)性(r=0.437,P=0.000)，表明HBV DNA復(fù)制可能依賴HBV cccDNA，其水平可在一定程度上反映HBV cccDNA存在情況。肝臟組織病理分期是判斷疾病進展的重要依據(jù)?！軬2/S2期患者PBMC內(nèi)HBV cccDNA拷貝數(shù)明顯高于小于G2/S2期以下患者(Z=4.378,P=0.001)，提示HBV cccDNA在宿主體內(nèi)持續(xù)存在可能導(dǎo)致疾病進展。HBV cccDNA是HBV DNA復(fù)制模板，HBV cccDNA本身不會引起肝組織損傷，但是其通過上調(diào)HBV DNA復(fù)制增加宿主體內(nèi)病毒載量，以此激發(fā)免疫系統(tǒng)對HBV感染肝細(xì)胞進行攻擊導(dǎo)致肝臟組織受損，而作為免疫活細(xì)胞的PBMC感染HBV可能會加重這種病理應(yīng)答[14]。

HBsAg、HBeAg是HBV DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯合成的HBV特異性病毒蛋白，其轉(zhuǎn)錄、調(diào)控及清除機制復(fù)雜，HBV cccDNA在此過程中如何發(fā)揮作用目前尚未完全闡明[15-16]。本研究結(jié)果顯示，PBMC內(nèi)HBV cccDNA與血清HBsAg呈明顯正相關(guān)(r=0.338,P=0.001)，提示PBMC內(nèi)HBV cccDNA可能會影響HBV表達。有學(xué)者認(rèn)為以血清HBsAg衡量肝組織內(nèi)HBV cccDNA還需考慮HBeAg狀態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性患者HBeAg與PBMC內(nèi)HBV cccDNA存在明顯正相關(guān)性(r=0.521,P=0.001)。HBeAg陽性是HBV復(fù)制活躍標(biāo)志，HBV cccDNA在細(xì)胞內(nèi)活動度增加可能會優(yōu)先上調(diào)HBeAg水平[17]。但是HBeAg陰性并不能表示HBV cccDNA或HBV DNA處于非活動狀態(tài)，因為部分患者存在HBV病毒前C區(qū)變異，HBeAg表達受限或不能表達。PBMC作為免疫活細(xì)胞，具有豐富的免疫信號傳導(dǎo)通路，能夠?qū)⒓?xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA遺傳信息進行有效輸出，影響HBsAg、HBeAg等特異性蛋白表達。

HBsAg陰轉(zhuǎn)被認(rèn)為是治療HBV感染的最理想狀態(tài)，但在實際抗病毒治療中出現(xiàn)HBsAg完全陰轉(zhuǎn)的病例非常少見，這可能與少量HBV cccDNA能夠穩(wěn)定存在感染細(xì)胞內(nèi)且不易受藥物影響有一定關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)cccDNA是慢性HBV持續(xù)感染的最主要原因，并且與抗病毒治療后復(fù)發(fā)相關(guān)，清除HBV cccDNA也被認(rèn)為是治療HBV的根本途徑。本研究進一步分析PBMC內(nèi)HBV cccDNA對HBV抗病毒治療效果判斷價值，結(jié)果顯示在抗病毒治療24、48周時PBMC內(nèi)HBV cccDNA水平可對病毒應(yīng)答進行判斷，在48周時具有最佳判斷效果，表明PBMC內(nèi)HBV cccDNA可以用于評價抗病毒治療效果，在治療過程中可將其作為常規(guī)監(jiān)測指標(biāo)，進一步凸顯PBMC內(nèi)HBV cccDNA檢測的臨床意義。

綜上所述，本研究證實HBV可感染PBMC，利用磁性納米富集及RCA可檢測PBMC內(nèi)HBV cccDNA。PBMC內(nèi)HBV cccDNA與HBV疾病進展有一定關(guān)系，也與血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平相關(guān)，可作為抗病毒治療效果判定指標(biāo)，對HBV患者檢測PBMC內(nèi)HBV cccDNA具有重要臨床意義。