壯醫(yī)藥線點灸對糖尿病性胃輕癱大鼠腦腸肽Ghrelin、CCK的影響*

張 勇，李蓓蕾，梁修朗，唐莫玲，黃梓健，范郁山

(1.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，南寧 530001)

糖尿病性胃輕癱(diabetic gastro paresis，DGP)是以胃動力障礙、胃排空延遲為主要特征的糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，超過50%的患者出現(xiàn)餐后飽脹感、反流、上腹不適、惡心、嘔吐、厭食等，嚴重影響生活質量[1-2]。DGP發(fā)病機制多認為與胃腸激素紊亂、Cajal間質細胞病變、自主神經病變有關[3]。胃腸激素是調控胃腸運動的重要因素，近年來有關胃腸激素研究逐漸增多，有代表意義的是促生長素(Ghrelin)和膽囊收縮素(CCK)[4]。腦腸肽是同時存在于胃腸道和大腦的胃腸激素或神經肽，對胃腸道運動、感覺和分泌功能具有調控作用。Ghrelin又稱胃饑餓素，是一種促進食欲的腦腸肽，是生長激素促分泌素受體(GHSR)的內源性配體，能夠促進生長激素(GH)分泌、增加食欲、促進攝食及胃腸運動[5]。CCK是由十二指腸I細胞分泌的廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)和胃腸道的胃腸激素，作為經典腦腸肽的一員，可以通過誘發(fā)中樞飽感信號、減少攝食行為和胃腸運動而抑制食欲[6-7]。目前臨床治療DGP常用促胃動力藥物以緩解癥狀，但遠期療效不佳，不良反應較多，且易產生耐藥性，尋找安全有效的防治方法具有重要的臨床意義[8]。近年來開展了大量的針刺治療DGP的研究，證實了針刺能有效治療DGP[9]，而有關灸法的研究較少報道，壯醫(yī)藥線點灸療法的研究尚處于起步階段，缺乏基礎研究和機制研究[10]。本實驗擬從食欲興奮劑Ghrelin和食欲抑制劑CCK這一對互相拮抗的腦腸肽作為研究的切入點，觀察壯醫(yī)藥線點灸對DGP大鼠的影響，探討壯醫(yī)藥線點灸治療DGP的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 80只6周齡清潔級SD大鼠,體質量(231±10)g，雌雄各半，購于長沙天勤生物公司[SCXK(湘)2014-0011]，所有大鼠均為同一批次，且一般體檢無異常。大鼠自由飲食攝水，分籠飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，12 h間斷光照的動物房。普通飼料和高脂飼料(蔗糖20%、豬油15%、奶粉5%、雞蛋2%、鼠維持飼料58%)，由沈陽市前民動物實驗飼料廠提供。

1.1.2主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma)；甲氧氯普胺片(山西云鵬制藥)；酚紅(天津光復精細化工)；大鼠Ghrelin、CCK ELISA試劑盒(南京建成生物工程)；Ghrelin兔抗多克隆抗體(英國Abcam)；血糖儀及血糖試紙(美國強生OneTouch)；TGL-18R臺式離心機(珠海黑馬)；DYY-12電泳儀、DYCZ-40AZ轉膜儀(北京六一)；AX-X射線攝影暗匣(廣東粵華)；酶標儀(美國Thermo)；UV-1800紫外分光光度計(日本島津)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 通過隨機數(shù)字表法將80只SD大鼠分為空白組20只和造模組60只，每組雌雄各半。將造模成功后的60只DGP大鼠再次隨機分成模型組、甲氧氯普胺組、壯醫(yī)藥線點灸組，每組20只。

1.2.2DGP大鼠模型建立 空白組大鼠給予普通飼料，造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周；第9周，造模組大鼠予2%STZ溶液(55 mg/kg)一次性腹腔注射破壞胰島細胞，并于注射后12、24、72 h采集鼠尾靜脈血測血糖值，選擇空腹血糖(FGB)≥16.65 mmol/L的成模大鼠納入實驗[11]。

1.2.3實驗方法 空白組、模型組灌胃同體積0.9%氯化鈉溶液；甲氧氯普胺組灌胃同體積1.7%甲氧氯普胺溶液，連續(xù)15 d，每次用藥體積按100 g體質量1 mL換算，實驗期間各組大鼠予普通飼料自由進食、飲水。壯醫(yī)藥線點灸組：選取直徑0.7 mm的2號線(由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供)統(tǒng)一采用重手法點灸，點灸方法參考《壯醫(yī)藥線點灸學》[12]按持線-點火-施灸步驟操作，每穴點灸3壯(線頭火星對準穴位，一按火滅即起為1壯)，連續(xù)15 d。施灸處方：“中脘”“內關”“足三里”“脾俞”“胃俞”均為雙側；取穴方法參考李忠仁[13]制訂的“動物針灸穴位圖譜”及解剖學定位。

1.2.4樣品制備和指標檢測 各組大鼠治療15 d后，禁食24 h、禁水2 h，采集大鼠尾靜脈血測FBG水平，然后用2 mL酚紅溶液(0.5 mg/mL)灌胃，30 min后以10%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔經腹主動脈采血，以3 000 r/min離心10 min后取上清液，ELISA法檢測血清Ghrelin水平。采血結束后，結扎賁門和幽門，取出大鼠全胃，沖洗胃內容物，定容20 mL，加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL靜置取上清液，再加入20%三氯乙酸去除蛋白，離心取上清液在560 nm波長紫外分光光度計下檢測吸光度值(OD)。用鑷子輕輕取出上至幽門、下至回盲瓣的小腸管并將小腸拉直鋪于白紙上，用直尺測量幽門到酚紅染成紅色末端距離(a)及幽門到回盲瓣全長(A)，取二者之比值即為小腸推進率。測量結束后，從大鼠全胃中剪取小段胃大彎組織，剪碎加PBS制成組織勻漿液，經研磨、離心、取上清液，用ELISA法檢測胃竇CCK水平；另剪取小段胃竇組織置于凍存管，保存在-80 ℃冰箱備用。胃排空率計算公式如下：

胃排空率=(1-實測酚紅OD值/標準酚紅OD值)×100%。

1.2.5Western blot檢測胃竇組織Ghrelin的表達水平 取出凍存的胃竇組織，加入RIPA裂解液充分裂解、勻漿、離心提取蛋白，并進行電泳、濕轉膜，分別加入一抗、二抗，ECL發(fā)光液顯色后將膜置于發(fā)光體系中檢測、顯影沖洗保存，以目的條帶和β-actin條帶灰度值比值進行相對定量分析。

2 結 果

2.1各組大鼠血糖水平比較 造模后與空白組比較，模型組、壯醫(yī)藥線點灸組、甲氧氯普胺組大鼠血糖水平明顯升高(P<0.01);與同組造模前比較，血糖水平也明顯升高(P<0.01)。經15 d治療后，壯醫(yī)藥線點灸組與模型組相比，血糖水平明顯下降(P<0.01)，且與本組造模后相比，血糖水平也明顯下降(P<0.01)；而甲氧氯普胺組與模型組血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

a：P<0.01，與造模前比較；b：P<0.01，與空白組比較；c：P<0.01，與壯醫(yī)藥線點灸組比較；d：P<0.01，與本組造模后比較

2.2各組大鼠胃排空率與小腸推進率比較 與空白組比較，模型組大鼠的胃排空率及小腸推進率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線點灸組、甲氧氯普胺組大鼠胃排空率及小腸推進率明顯增強 (P<0.01)；而壯醫(yī)藥線點灸組與甲氧氯普胺組大鼠胃排空率及小腸推進率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較

2.3各組大鼠Ghrelin、CCK水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清Ghrelin水平明顯減少(P<0.01)，胃竇CCK水平明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線點灸組大鼠血清Ghrelin水平明顯增加(P<0.01)，胃竇CCK水平明顯降低(P<0.01)；與甲氧氯普胺組比較，壯醫(yī)藥線點灸組大鼠血清Ghrelin水平增加(P<0.05)，胃竇CCK水平降低(P<0.05)，見圖3、4。

2.4各組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線點灸組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達明顯上升(P<0.05)；甲氧氯普胺組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.05，與甲氧氯普胺組比較

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.05，與甲氧氯普胺組比較

A空白組，B模型組，C壯醫(yī)藥線點灸組，D甲氧氯普胺組。a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

近年來，隨著生活水平的提高、飲食結構的改變，糖尿病的發(fā)病率在世界范圍內快速增長，已成為繼心血管病和腫瘤之外的第三大非傳染性疾病。DGP是糖尿病最常見的胃腸道并發(fā)癥，不僅會引起頑固性嘔吐、厭食、營養(yǎng)不良，而且影響口服藥物吸收變化，造成血糖難以控制，甚至造成餐后低血糖危險、電解質紊亂、難治性糖尿病的發(fā)生[14]。DGP歸屬于壯醫(yī)學理論的“谷道病”范疇，其病機是谷道虛損、毒邪阻滯“龍路”、“火路”氣機、“巧塢”淤滯，其根本治法是調氣補虛解毒[10]?！白闳铩笔俏钢潞涎ǎ昂现蝺雀?，擅長治療胃腸系統(tǒng)疾患；“內關”是止嘔要穴，有和中降逆，消積導滯之效；“脾俞、胃俞”是脾胃二臟的背俞穴，可外散水濕于膀胱經，內調脾胃之氣，與胃俞募穴、“腑會”中脘穴“俞募配穴”，一陰一陽，可使清陽上升、濁陰下降，恢復脾胃氣機升降。有研究表明，使用上述5穴均能增強胃動力，改善胃腸功能[15-16]。通過獨特壯藥浸泡的壯醫(yī)藥線點灸以上諸穴，既能發(fā)揮針灸疏通經絡、健脾和胃的作用，又能調氣補虛、化食解毒，使“壯醫(yī)三氣”復歸同步。

DGP發(fā)生的本質是胃腸功能的紊亂，表現(xiàn)在消化間期推進性復合波(MMC)Ⅲ期消失，餐后胃、十二指腸收縮不協(xié)調，幽門括約肌痙攣，胃排空異常[3]；而腦腸肽通過迷走神經介導，可以在中樞和外周途徑上對胃運動和胃排空進行精細調節(jié)，對胃腸功能的調節(jié)起重要調控作用[4,17]。Ghrelin是第一種被證明能刺激進食的循環(huán)激素，具有誘發(fā)MMCⅢ期收縮、提高胃竇幽門協(xié)調運動、促進胃腸蠕動的作用，通過與其受體GHSR結合后在中樞和外周途徑發(fā)揮作用[18]。在大腦中，Ghrelin與受體GHSR結合后激活下丘腦弓狀核(Arc)-外側隔核Ghrelin神經通路[19]、海馬CA1區(qū)-下丘腦Arc Ghrelin神經通路[20]，下丘腦外側區(qū)-延髓迷走神經復合體-迷走神經軸等多個中樞神經核團，并最終激活神經肽Y/刺鼠色蛋白相關蛋白神經元(NPY/AGRP)[21]，上調胃牽張敏感神經元放電活動[22]，從而介導胃腸運動和多食行為；并且Ghrelin受體阻滯劑(D-Lys3-GHRP-6)可完全阻斷上述神經通路的激活及胃牽張敏感神經元放電效應[23]。在外周途徑中，Ghrelin通過與分布在肌間神經叢、黏膜下神經叢、迷走神經傳入纖維上的GHSR受體結合促進胃酸分泌和胃腸蠕動，協(xié)調胃竇、幽門與十二指腸運動，此過程可被阿托品和迷走神經切斷術所阻斷[24]。

CCK作為一種經典的腦腸肽，不僅參與胃腸功能的調節(jié)，同時對中樞神經系統(tǒng)飽感信號產生、食欲調節(jié)方面有著重要作用[25]。在大腦中，CCK作為一種飽感信號，通過激活“下丘腦背內側核(DMH)CCK-NPY”信號通路，上調下丘腦室旁核(PVN) 促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)基因表達，抑制Arc NPY表達，激活外周飽感傳入樞紐阿片黑色神經元(POMC)，發(fā)揮控制攝食和能量代謝平衡作用[26-27]；而對CCK受體基因先天缺失(OLETF)大鼠的研究也表明，CCK受體缺失引起DMH NPY高度表達促進了OLETF大鼠肥胖和糖尿病形成[28]。外周途徑中，CCK一方面與分布在胃竇、幽門、小腸黏膜上及腸道分支迷走傳入神經上的受體結合，松弛近端胃竇、增加胃的順應性，提高幽門括約肌緊張度，抑制胃竇和近端十二指腸蠕動，從而延緩胃排空；另一方面，通過促進膽囊收縮和胰腺分泌，提高胰酶活性，有助于脂肪和蛋白的消化吸收，從而抑制進食；并且生理或藥物劑量的CCK均能抑制進食后的胃排空[7,29]。

有臨床實驗發(fā)現(xiàn)，DGP患者往往伴隨著腦腸肽Ghrelin和CCK紊亂，而靜脈注射Ghrelin激動劑能明顯改善DGP患者食欲缺乏，對于結腸部分切除術后腸梗阻也有良好的治療效果[30]；此外，靜脈注射CCK能減少肥胖患者攝食量，基于CCK的方法可治療肥胖[31]。相關實驗證明，電針足三里等穴可上調胃竇部Ghrelin、GHSR mRNA表達，降低胃竇CCK水平[3,32]。本研究結果顯示，胃腸運動功能下降與胃竇部Ghrelin和CCK分泌紊亂、Ghrelin蛋白表達下降相關，與上述研究結果一致。并且，經壯醫(yī)藥線點灸干預后，壯醫(yī)藥線點灸組大鼠胃排空率和小腸推進率提高，胃竇Ghrelin水平及蛋白表達水平增加，胃竇CCK水平下降，提示壯醫(yī)藥線點灸“中脘”等穴改善胃運動的機制可能是上調血清Ghrelin水平并下調胃竇CCK水平，促進Ghrelin在胃竇部蛋白表達，通過中樞和外周途徑調節(jié)腦腸肽分泌紊亂狀態(tài)。然而，這一過程涉及到的機制十分復雜，尚有待后續(xù)進一步研究。