癌源外泌體的制備及其對胃癌細胞STK15表達的影響*

楊 勇,陳 霖,楊宏新,李 磊,于 建,何源哈達,楊 晨,徐 偉，高艷偉，高維實

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤外科，呼和浩特 010017;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059;3.湖北省宜昌市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科 443000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院中西醫(yī)科，呼和浩特 010017)

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤的生物治療成為國際研究的熱點。近幾年具有亞細胞結(jié)構(gòu)的外泌體(exosomes)日益受到重視，有學(xué)者預(yù)言外泌體可能會成為未來疾病診斷和治療的工具[1]。外泌體源自細胞并通過胞吐方式分泌到細胞外，是具有膜性結(jié)構(gòu)的小囊泡[2]，來源于不同細胞的外泌體所含成分也不同，目前已證實很多類型細胞都能釋放外泌體，但外泌體負載的抗原物質(zhì)存在很大差異，所以對不同來源的外泌體的深入研究對于腫瘤的個性化治療顯得非常重要[3]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15(serine/threonine kinase 15，STK15)是中心體擴增相關(guān)基因，與細胞有絲分裂相關(guān)，有學(xué)者把其作為中心體擴增的標(biāo)記物。早期有學(xué)者認為外泌體有抗腫瘤作用，有人推測其可能會成為抗腫瘤疫苗[4]，但隨研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其負載腫瘤抗原有促進腫瘤細胞增殖作用[5-6]，故本研究以胃癌MGC-803細胞為模型，從其培養(yǎng)上清液中制備胃癌細胞分泌的外泌體，然后通過體外實驗證明外泌體對胃癌細胞的作用，以及對胃癌細胞產(chǎn)生效應(yīng)的可能機制，為今后外泌體腫瘤疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人低分化胃癌細胞株MGC-803為本實驗室常規(guī)傳代保存。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，二辛可寧酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，STK15一抗購自美國GeneTex公司，鏈霉卵白素-過氧化物酶(S-P)檢測試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示試劑盒及多聚賴氨酸購自福建邁新試劑公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 胃癌MGC-803細胞液氮取出復(fù)蘇后，置于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，平均3～4 d傳代1次，所有實驗均采用對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2外泌體的制備及蛋白定量 胃癌MGC-803細胞用75 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，除去含血清培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，隨后加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集上清制備外泌體。(1)收集的上清液1 500 r/min離心10 min，3 500 r/min離心10 min;(2)采用15 000 r/min離心30 min，去除細胞及細胞碎片等物；(3)50 000 r/min離心2 h，用無菌PBS液稀釋沉淀物、采用濾器除菌(0.22 μm)。首先采用BCA法用標(biāo)準(zhǔn)品測定得到蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得外泌體蛋白水平。將沉淀物分裝在小離心管中，取出部分外泌體進行電鏡檢測，其余小管-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3電鏡鑒定外泌體結(jié)構(gòu) 將20 μL外泌體懸液滴加在載樣銅網(wǎng)上，室溫條件靜置1 min后將銅網(wǎng)上多余液體用濾紙從側(cè)面吸干，在銅網(wǎng)上滴加pH值為6.8的磷鎢酸溶液(3%)30 μL，1 min后將磷鎢酸用濾紙吸干，室溫靜置10 min后在透射電鏡下觀察外泌體并照像。

1.2.4胃癌細胞增殖活力檢測 將對數(shù)生長期的MGC-803細胞用常規(guī)胰酶消化，PBS洗滌后再制成單細胞懸液，采用96孔板進行細胞培養(yǎng)，每孔接種100 μL細胞懸液(1×104個/mL)，培養(yǎng)12 h后，分別加入終濃度為0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。實驗設(shè)置實驗對照組及空白對照組，每組設(shè)8個復(fù)孔，每孔終體積為180 μL。培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL，孵育4 h后吸棄上清，然后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻。570 nm波長條件下用酶標(biāo)儀測定各孔平均吸光度值。

1.2.5細胞增殖相關(guān)基因STK15表達變化 將包被多聚賴氨酸蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后加入濃度為0、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。培養(yǎng)24 h后將蓋玻片取出放置于丙酮液中固定15 min，蒸餾水洗滌后，滴加3%的過氧化氫10 min，PBS洗滌，滴加血清封閉液10 min，滴加STK15一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對照。次日PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液10 min，PBS洗滌，滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化酶10 min，PBS洗滌，滴加DAB顯色液5 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。采用彩色圖像分析系統(tǒng)測量陽性反應(yīng)物的灰度值，在40倍視野下每張片子隨機測量4個視野取其平均值代表STK15染色強度。

2 結(jié) 果

2.1外泌體的制備和蛋白定量 胃癌MGC-803細胞按照上述方法經(jīng)超速梯度離心后得到外泌體，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品測定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.653 4X-0.005 8，測得制備的外泌體濃度為13.39 μg/μL。

圖1 倒置顯微鏡下胃癌MGC-803細胞(×200)

2.2外泌體的形態(tài)學(xué)鑒定 光學(xué)顯微鏡下可以看到胃癌細胞呈現(xiàn)梭形、多角形(圖1)，通過超速梯度離心法從胃癌MGC-803細胞上清液中得到外泌體，在透射電鏡下觀察到外泌體呈現(xiàn)圓形或橢圓形小囊泡，具有特征性的盤狀結(jié)構(gòu)，有完整的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)，直徑為50～130 nm，見圖2。

2.3外泌體對MGC-803細胞活力的影響 制備的外泌體與胃癌MGC-803細胞共培養(yǎng)，經(jīng)MTT結(jié)果顯示外泌體隨著濃度從0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL升高，570 nm波長平均吸光度值升高，隨著時間延長吸光度值亦升高，通過方差齊性檢驗和方差分析后證實各時間節(jié)點的組間增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，外泌體以時間和劑量依賴性方式促進胃癌MGC-803細胞增殖，見表1。

圖2 透射電鏡下的外泌體(×15 000)

a:P<0.05，與0 μg/μL外泌體組比較；b：P<0.05，與0.50 μg/μL外泌體組比較

A:0 μg/μL外泌體組;B:0.20 μg/μL外泌體組;C:0.50 μg/μL外泌體組

圖3 MGC-803細胞0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達(×400)

2.4免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，STK15蛋白陽性反應(yīng)物主要定位于細胞核，部分細胞質(zhì)也有表達，陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，0.50 μg/μL外泌體的STK5表達高于0.20 μg/μL外泌體組，0.20 μg/μL外泌體組STK15表達高于MGC803細胞組，各組間表達強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達，見圖3。

3 討 論

外泌體作為一種膜性小泡，最初是用來描述由網(wǎng)織紅細胞分泌的小囊泡，直徑為30～100 nm，呈現(xiàn)扁球體狀，外膜為磷脂雙分子層，在囊泡表面負載豐富的膜性分子，這些膜性分子與其功能和來源相關(guān)[7]。目前認為外泌體是由細胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體的界膜向內(nèi)凹陷出芽形成許多小泡，稱之為多泡體(multivesicular bodies，MVB)，當(dāng)MVB膜與細胞膜融合后，再形成小泡被釋放至細胞外空間，這種小泡被稱之為外泌體。外泌體的膜也是由磷脂雙分子層組成，由于脂類分子可以進行不間斷運動，這樣外泌體可與具有膜性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)不斷融合來交換物質(zhì)，蘊含的生物信息逐漸被接觸的細胞所容納。目前人們知道，細胞之間的信息傳遞過程非常復(fù)雜，許多細節(jié)需要詮釋，誰來扮演細胞之間的“信使”是目前這個領(lǐng)域亟待需要解決的難題。外泌體小泡表面負載活性物質(zhì)很多[8]，腫瘤細胞源的外泌體，負載信息更多[2]，作用更為復(fù)雜[9-10]。甚至有學(xué)者認為，不同類型腫瘤細胞共表達的腫瘤共同抗原可能就存在于外泌體囊泡上，外泌體可能以自分泌和旁分泌形式影響癌細胞和正常細胞之間的信息傳遞[11]。通過外泌體載體傳遞抗原給抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞)，介導(dǎo)CD4+T細胞免疫反應(yīng)來治療同基因源性和異基因源性腫瘤顯示巨大潛力。

有效、安全、穩(wěn)定和實用是腫瘤理想的治療性疫苗應(yīng)該具備的基本特征。從目前研究結(jié)果看腫瘤源外泌體具有膜的結(jié)構(gòu)特征，大小只有100 nm左右，甚至更小，負載了腫瘤細胞的特征分子，具有納米疫苗的特征，可以作為一種新型的亞細胞疫苗，當(dāng)然其免疫原性、安全性、免疫反應(yīng)性、耐受性等需要在實驗中進一步驗證。腫瘤源外泌體疫苗，由于其負載腫瘤相關(guān)抗原多，與細胞膜有特殊的可融合性，在細胞間的信息傳遞過程中發(fā)揮巨大作用，而作為腫瘤疫苗與其他腫瘤肽疫苗、核酸疫苗相比，從理論上可激發(fā)的免疫反應(yīng)更強烈，甚至在上述疫苗無效的情況下也可能誘導(dǎo)明顯的免疫應(yīng)答。早期有研究報道當(dāng)接種L1210細胞分泌的外泌體，移植性腫瘤細胞的生長可部分被抑制；抗腫瘤的T細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)可被來自熱休克淋巴瘤細胞的外泌體誘導(dǎo)[12]。王東關(guān)等[13]發(fā)現(xiàn)，樹突狀淋巴細胞可被腫瘤源外泌體活化成為特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，來殺傷腫瘤細胞。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展，人們采用CRISPR/Cas9技術(shù)對腫瘤細胞的基因編輯工作更為簡單，而外泌體作為細胞分泌的小泡，應(yīng)該負載基因編輯后腫瘤細胞的特殊抗原，所以外泌體作為免疫調(diào)控和腫瘤治療的工具或藥物載體顯示巨大潛力[1,14-15]。本研究采用超速離心法制備的腫瘤細胞外泌體，經(jīng)電鏡證實具有外泌體的特征。將制備外泌體作用于胃癌MGC803細胞，發(fā)現(xiàn)其可促進胃癌細胞生長，而且隨外泌體濃度增加對胃癌細胞的增殖作用也增強，同時隨著時間延長胃癌細胞增殖活性也越強，腫瘤源外泌體對胃癌細胞的生長作用具有時間和濃度依賴性。研究結(jié)果提示外泌體負載重要腫瘤抗原，由其傳遞給抗原呈遞細胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)可能非常強烈。

STK15基因編碼一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是中心體擴增相關(guān)激酶，其定位于中心體，位于染色體周圍，是細胞增殖過程的關(guān)鍵基因[16],在細胞周期的G1/S期開始出現(xiàn)。中心體作為細胞主要微管組織中心，在細胞有絲分裂期可形成兩極紡錘體，STK15不僅參與中心體的復(fù)制、分離和成熟，而且還參與紡錘體兩極的組裝與穩(wěn)定性維持。當(dāng)細胞周期結(jié)束后STK15迅速通過泛素化降解途徑降解，STK15的精確適時表達在細胞有絲分裂中起重要作用。當(dāng)正常細胞STK15表達不容易檢測到，但細胞癌變后STK15高表達，結(jié)果導(dǎo)致多級紡錘絲形成，染色體不均等分離，遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，出現(xiàn)腫瘤惡性特征。有研究結(jié)果證實STK15可以轉(zhuǎn)化NTKT3細胞，使免疫缺陷裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，STK15是細胞增殖過程的重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌MGC803細胞STK15有少量表達，加入0.20 μg/μL和0.50 μg/μL濃度的外泌體后，其表達水平逐漸增高(P<0.05)，而細胞增殖活性也逐步提高(P<0.05)，胃癌源外泌體攜帶抗原成分可使胃癌細胞的STK15基因過表達，從而加速腫瘤細胞增殖分裂。研究也提示制備的外泌體充當(dāng)了“信使”，通過膜分子的相互作用將中心體復(fù)制相關(guān)蛋白傳遞給胃癌細胞，導(dǎo)致胃癌細胞增殖加速。

外泌體最近已經(jīng)成為癌癥和其他疾病中潛在有希望的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。本研究提示腫瘤源的外泌體或經(jīng)基因修飾后的外泌體可能在腫瘤免疫治療方面具有更大的生機。有研究表明，在免疫應(yīng)答下調(diào)或誘導(dǎo)免疫耐受過程中外泌體也在發(fā)揮作用，如外泌體通過誘導(dǎo)免疫耐受促進了腫瘤細胞的生長[18]，這給腫瘤治療提出新的挑戰(zhàn)，需要深入研究。