臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌分型及其耐藥表型檢測的研究*

范厚臻，孫運(yùn)芳

(1.山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 276003;2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗(yàn)系，山東臨沂 276000)

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是引起醫(yī)院感染的主要病菌，已成為僅次于大腸埃希菌后第二致病菌，根據(jù)致病性不同常分為普通肺炎克雷伯菌(classic klebsiella pneumoniae)與高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent klebsiella pneumoniae)[1]。與普通肺炎克雷伯菌比較，高毒力肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為可感染無基礎(chǔ)疾病人群、首要癥狀為原發(fā)性肝膿腫、培養(yǎng)菌落為高黏性等特點(diǎn)[2-3]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，高毒力肺炎克雷伯菌多表現(xiàn)為K1、K1莢膜血清型，這兩種莢膜血清型也是社區(qū)獲得性感染的關(guān)鍵毒力因子[4]。耐藥肺炎克雷伯菌感染是抗感染治療中面臨的最嚴(yán)重問題，有學(xué)者報(bào)道高毒力肺炎克雷伯菌感染超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株檢出率為20.7%～65.2%[5]。自我國臺灣學(xué)者報(bào)道高毒力肺炎克雷伯菌以來，目前所報(bào)道病例多集中于亞洲地區(qū)與亞裔居民[6]。高毒力肺炎克雷伯菌感染是否具有地域或體質(zhì)易感性，目前學(xué)者研究較少。本文以此為背景，回顧性分析臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床資料，探討高毒力克雷伯菌分型、耐藥表型與感染的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2015年1月至2017年9月臨沂市中醫(yī)醫(yī)院住院患者分離肺炎克雷伯菌98株及病歷資料，所有患者均出現(xiàn)肺炎克雷伯菌感染且細(xì)菌培養(yǎng)成陽性，排除合并其他病原菌感染者。

1.2主要儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定儀：法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀：美國Bio-Rad公司PTC-200；電泳儀：美國Bio-Rad公司DYY-6D；凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；PCR試劑與DNA marker Ⅰ：大連TaKaRa生物公司。

1.3檢測方法

1.3.1菌株分離培養(yǎng) 98株肺炎克雷伯菌直接接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑單一菌落進(jìn)行分純孵育，采用全自動(dòng)微生物鑒定儀重新鑒定菌株，PCR擴(kuò)增測序確認(rèn)。

1.3.2高黏液表型檢測 采用拉絲試驗(yàn)方法，使用接種環(huán)挑取血瓊脂平板上新鮮菌落進(jìn)行牽拉，重復(fù)2次。黏液絲形成且長度大于或等于5 mm則判斷為高黏液表型陽性，黏液絲形成且長度小于5 mm判斷為陰性[7]。

1.3.3藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對9種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇肺炎克雷伯菌ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室化協(xié)會(huì)(CLSI)2013年版評估藥敏結(jié)果[8]。

1.3.4肺炎克雷伯菌血清型檢測 參照WEI等[9]文獻(xiàn)資料，采用多重PCR檢測K1、K2、K5、K20、K54、K57等6種高毒力血清型基因。

1.3.5肺炎克雷伯菌株毒力基因檢測 參照黎斌斌等[10]文獻(xiàn)資料，采用PCR檢測普通肺炎克雷菌、高毒力肺炎克雷伯菌毒力rmpA基因攜帶情況。

1.3.6高毒力肺炎克雷伯菌菌株確認(rèn) 參照黎斌斌等[10]文獻(xiàn)資料，將拉絲試驗(yàn)與rmpA基因均為陽性的黏液型菌株認(rèn)定為高毒力株。

1.3.7多位點(diǎn)序列分析(MLST) 參照黎斌斌等[10]文獻(xiàn)資料，對管家基因擴(kuò)增測序分析，根據(jù)多位點(diǎn)序列分析數(shù)據(jù)確定等位基因與ST型。

2 結(jié) 果

2.1高毒力肺炎克雷伯菌菌株檢出情況 98株肺炎克雷伯菌中，拉絲試驗(yàn)檢出高毒力肺炎克雷伯菌33株(33.67%)。

表1 肺炎克雷伯菌感染臨床特征分析

2.2臨床特征 98例肺炎克雷伯菌感染患者中，男74例，女24例；年齡45～78歲，平均(61.33±7.35)歲；感染獲得途徑：醫(yī)院獲得性感染57例，社區(qū)獲得性感染41例；感染部位：呼吸道74例，腹腔消化道6例，皮膚切口5例，尿液8例，其他5例；預(yù)后情況：治愈7例，好轉(zhuǎn)75例，無效10例，死亡8例。高毒力肺炎克雷伯菌感染與普通肺克雷伯菌感染性別、年齡、感染部位、預(yù)后等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌感染社區(qū)獲得性感染率(63.64%)明顯高于普通肺炎克雷伯菌感染(30.77%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3分子特征 98例肺炎克雷伯菌感染菌株中，血清型：K1型16株，K2型9株，K5型5株，K20型4株，K57型64株；rmpA基因：陽性41株，陰性57株；MLST分型：ST23型22株，ST15型7株，ST11型5株，ST65型5株，其他59株。高毒力肺炎克雷伯菌K1與K2型占比60.61%(20/33)明顯高于普通肺炎克雷伯菌菌株7.69%(5/65)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.000,P<0.01)；rmpA基因陽性率100.00%(33/33)明顯高于普通肺炎伯雷菌菌株(12.31%，8/65)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.000,P<0.01)；ST23型51.52%(17/33)明顯高于普通肺炎伯雷菌菌株7.69%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.000,P<0.01)。見表2。

表2 肺炎克雷伯菌感染分子特征分析(n)

2.4抗生素敏感性試驗(yàn) 高毒力肺炎克雷伯菌、普通肺炎克雷伯菌對美羅培南敏感性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢唑林、氨曲南、哌拉西林、復(fù)方磺胺甲噁唑敏感率均明顯高于普通肺炎克雷伯菌，超廣譜β內(nèi)酰胺酶檢出率低于普通肺炎克雷伯菌(P<0.05)。見表3。

表3 肺炎克雷伯菌對常用抗生素陽性率分析[n(%)]

3 討 論

既往研究高毒力肺炎克雷伯菌主要集中在亞洲或亞裔人群，這是否意味著有地域易感性或體質(zhì)易感性。臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征與我國其他地區(qū)是否存在差異，作者前期研究中并未進(jìn)行分析[11]。本文研究中98例肺炎克雷伯菌感染血癥患者中，檢出高毒力肺炎克雷伯菌感染33例，普通肺炎克雷伯菌感染65例，兩者在性別、年齡、感染部位等比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高毒力肺炎克雷伯菌感染社區(qū)獲得性感染率明顯高于普通肺炎克雷伯菌。與黎斌斌等[10]報(bào)道的北京朝陽醫(yī)院、魏丹丹等[12]報(bào)道的南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院基本相似，說明臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征與我國其他地區(qū)并沒有本質(zhì)上的差異；同時(shí)說明高毒力肺炎克雷伯菌感染菌株與社區(qū)獲得性肝膿腫明顯相關(guān)，而且部分患者并沒有任何基礎(chǔ)疾病。

高毒力肺炎克雷伯菌感染具有高侵襲性、高致死率以及潛在嚴(yán)重后遺癥的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命健康[13]。分析高毒力肺炎克雷伯菌株分子特征對于患者診斷治療尤為重要。肺炎克雷伯菌菌體表面莢膜是肺炎克雷伯菌主要毒力因子之一，能夠誘導(dǎo)菌體拮抗宿主免疫殺傷作用[14]。根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)與抗原性的差異，目前至少可以分為78個(gè)莢膜血清型。相關(guān)研究表明，K1、K2、K5、K20、K54、K57等6種血清型與高毒力肺炎克雷菌明顯相關(guān)，也是誘導(dǎo)各種侵襲性感染的主要血清型菌株[15-16]。本研究中，K1、K2是高毒性力肺炎克雷伯菌感染的主要血清型，占比達(dá)60.61%(20/33)，未檢出K54血清型，與魏丹丹等[17]報(bào)道類似。可能與K1、K2型肺炎克雷伯菌莢膜合成能力較強(qiáng)、可拮抗吞噬細(xì)胞吞噬作用等因素有關(guān)。多位點(diǎn)序列分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌感染主要表現(xiàn)為ST23型(51.52%，17/33)，這也是社區(qū)獲得性肝膿腫的主要肺炎克雷伯菌血清型，與蘇桂新等[18]文獻(xiàn)報(bào)道基本相似。

抗生素檢出分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等8種抗生素陽性率均高于普通肺炎克雷伯菌，ESBLs陽性率明顯低于普通肺炎克雷伯菌，說明高毒力肺炎克雷伯菌對ESBLs耐藥性明顯低于普通肺炎克雷伯菌，同時(shí)出現(xiàn)多重耐藥性，給臨床抗感染治療造成困難。

本文研究結(jié)果表明，臨沂地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌多為社區(qū)獲得性感染，莢膜血清以K1與K2型為主，絕大多數(shù)攜帶rmpA毒力基因，ST23為主要流行菌株，對常用抗生素高度敏感，同時(shí)檢出ESBLs陽性菌株與碳?xì)涿瓜╊惸退幘?。臨床醫(yī)生應(yīng)分析高毒力肺炎克雷伯菌感染臨床特征、分子特征及抗生素耐藥性情況，給予早期診斷與治療。