轉(zhuǎn)錄因子CP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義*

陳 麗，付 丹，陳 霞

(四川省成都市第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科 610051)

據(jù)國(guó)家癌癥中心全國(guó)最新癌癥報(bào)告顯示，我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率為278.07/10萬，病死率為167.89/10萬。其中，結(jié)直腸癌發(fā)病率已躍居惡性腫瘤第3位。截止2010年，我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)已超過27萬，死亡病例13萬以上,且有逐年增加的趨勢(shì)[1]。這主要與結(jié)直腸癌晚期的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，目前對(duì)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究仍未找到可靠、敏感的判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子CP2(transcription factor CP2，TFCP2)最初被認(rèn)為其與小鼠a球蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，通過增加TFCP2的表達(dá)后，激活a球蛋白的表達(dá)，可在體外誘導(dǎo)鼠白血病(MEL)細(xì)胞的分化[2]。近年來，TFCP2與腫瘤之間的關(guān)系得到越來越多研究者的報(bào)道。該轉(zhuǎn)錄因子在不同的腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)其扮演了不一樣的角色功能。有研究表明，TFCP2通過β-catenin/TCF 信號(hào)通路的激活，發(fā)揮癌基因的作用，可增加前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[3]。而在惡性黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2扮演的是抑癌基因的功能，TFCP2的高表達(dá)可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。此外，TFCP2還參與了腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)腫瘤血管生成。與各種癌癥發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)，如肝癌、胰腺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、乳腺癌和甲狀腺癌等[2]。然而，TFCP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與結(jié)直腸癌的臨床病理參數(shù)之間是否存在一定的相關(guān)性，目前尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western blot方法，在結(jié)直腸癌及癌旁結(jié)直腸黏膜組織中，對(duì)該基因做進(jìn)一步深入研究。以期對(duì)臨床結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后判斷提供有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 臨床病理材料收集來自本院2011-2017年臨床結(jié)直腸癌手術(shù)送檢標(biāo)本，共128例?；颊吣挲g33～82歲，中位年齡56歲，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。癌旁結(jié)直腸黏膜組織均取自距腫瘤原發(fā)灶大于5 cm的切除腸管。Western blot、 RT-PCR檢測(cè)所采用的組織標(biāo)本，均來自本院2017年結(jié)直腸癌手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本。本課題所有研究方法中的配對(duì)標(biāo)本，采用的是同一患者手術(shù)切除的結(jié)直腸癌和其相對(duì)應(yīng)的癌旁結(jié)直腸黏膜組織。

1.2方法

1.2.1主要試劑 一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，β-Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。免疫組織化學(xué)染色SP檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RT-PCR SYBR GreenⅠ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)及免疫組織化學(xué)染色 用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，證實(shí)為結(jié)直腸癌的病理診斷。其后，采用免疫組織化學(xué)SP法染色，比較結(jié)直腸癌和癌旁結(jié)直腸黏膜組織中TFCP2的表達(dá)。主要步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行：脫蠟，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)，過氧化氫作用;正常山羊血清封閉；一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗體1∶200，4 ℃過夜;辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37 ℃作用1 h；辣根過氧化物酶作用30 min；DAB顯色，出現(xiàn)棕黃色著色后自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，作為陰性對(duì)照。

1.2.3RT-PCR 提取結(jié)直腸癌和癌旁結(jié)直腸組織RNA(按照TaKaRa試劑說明進(jìn)行)。測(cè)定標(biāo)本濃度，PCR反應(yīng)(TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)10 μL體系按說明書進(jìn)行,TFCP2引物序列按照參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，具體引物序列為：正向5′-TGG CTT CAA CAG TTC CCA TA-3′，反向5′-TCT GGC TGG TGG TTT GGT-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列為:正向5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC-3′，反向5′-ATG GAC TGT GGT CAT GAG TCC-3′。

1.2.4Western blot 配制10%分離膠，5%濃縮膠。依次加入Marker 5 μL(加拿大Fermentas公司)，待測(cè)樣品20 μL。半干法轉(zhuǎn)膜：采用聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Milliore公司)。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗印跡膜2次，放入5%蛋白封閉液(武漢博士徳)，室溫封閉4 h。一抗孵育：TFCP2按1∶1 000稀釋，內(nèi)參Tubulin按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；二抗孵育，室溫作用2 h。ECL顯色：避光，在凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)中觀察、拍照。

1.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷 顯微鏡下觀察每例標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色表達(dá)情況：TFCP2表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性染色為淺棕色至棕褐色。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]方法評(píng)估染色結(jié)果，采用染色百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相結(jié)合方法。染色百分比評(píng)分：沒有陽(yáng)性信號(hào)為0分，1%～10%細(xì)胞著色計(jì)為1分，11%～50%的細(xì)胞著色計(jì)為2分，51%～80%細(xì)胞著色計(jì)為3分，大于80%細(xì)胞著色計(jì)為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，弱陽(yáng)性為1分，中等陽(yáng)性為2分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分。最后將染色陽(yáng)性百分比得分與染色強(qiáng)度得分結(jié)果相乘，總分為0～12分，總分小于或等于6分設(shè)為陰性，大于6分設(shè)為陽(yáng)性。病理閱片由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師雙盲評(píng)分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較結(jié)直腸癌與癌旁結(jié)直腸黏膜組織間以及腫瘤不同臨床病理參數(shù)間TFCP2表達(dá)陽(yáng)性率差異采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TFCP2的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示結(jié)直腸癌組織及癌旁結(jié)直腸黏膜組織中TFCP2的表達(dá)情況，TFCP2蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)，在不同TNM分期的結(jié)直腸癌中其表達(dá)具有異質(zhì)性，見圖1。TFCP2的表達(dá)在低分化的結(jié)直腸癌組織的表達(dá)強(qiáng)于高、中分化的結(jié)直腸癌組織。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，128例的結(jié)直腸癌及癌旁結(jié)直腸黏膜組織中TFCP2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86%和21%。

A：癌旁結(jié)直腸黏膜組織；B：高、中分化結(jié)直腸癌組織；C：低分化結(jié)直腸癌組織

圖1TFCP2在癌旁結(jié)直腸黏膜及癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

2.2RT-PCR結(jié)果 5例配對(duì)標(biāo)本中，結(jié)直腸癌組織TFCP2 mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁結(jié)直腸黏膜組織，前者是后者的1.40～17.00倍。見圖2。

2.3Western blot結(jié)果 TFCP2在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)量是對(duì)應(yīng)癌旁結(jié)直腸黏膜組織中的1.01～3.56倍。見圖3。

2.4TFCP2的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性 128例的結(jié)直腸癌標(biāo)本按照臨床病理特征分組，TFCP2的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤大小等無顯著相關(guān)性，與浸潤(rùn)深度、分化程度、Dukes′分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有顯著相關(guān)性(表1)。結(jié)直腸癌組織中TFCP2的表達(dá)為陰性和陽(yáng)性分別為18/128(14.1%)和110/128(85.9%)，而癌旁結(jié)直腸黏膜組織中TFCP2的陰性表達(dá)和陽(yáng)性表達(dá)分別為101/128(78.9%)和27/128(21.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 結(jié)直腸癌及癌旁結(jié)直腸黏膜組織中TFCP2 mRNA的表達(dá)水平

圖3 TFCP2在結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)本及癌旁結(jié)直腸黏膜組織中的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

TFCP2的DNA結(jié)合域有一個(gè)特點(diǎn)，它類似免疫蛋白的結(jié)構(gòu)，與腫瘤抑制基因TP53相類似，因此其被認(rèn)為很可能是p53基因的前體[6]。TFCP2也被認(rèn)為可能扮演了抑癌基因的功能。然而，隨著研究者不斷地研究發(fā)現(xiàn)，TFCP2在不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮了不同作用。一方面發(fā)揮了促癌的作用，例如，在對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在超過90%的肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)本，相對(duì)于正常肝組織，TFCP2是呈高表達(dá)的，它的表達(dá)水平與肝細(xì)胞性肝癌的進(jìn)展密切相關(guān)[7]。在對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)是顯著增強(qiáng)的，它與腫瘤TNM分期相關(guān)[8]。在對(duì)宮頸癌、卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)TFCP2的表達(dá)和腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[9-10]。β-catenin/TCF信號(hào)通路在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了極其重要的作用[11]。有研究者在對(duì)胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2可以激活β-catenin/TCF信號(hào)通路，從而促進(jìn)了胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[3]。然而β-catenin/TCF這條通路同樣在結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[12]。因此，TFCP2在結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中是否發(fā)揮此作用還有待進(jìn)一步研究。另一方面，有研究者在對(duì)惡性黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2在惡性黑素瘤腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了抑癌基因的功能。TFCP2的過度表達(dá)抑制了惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。TFCP2與死亡相關(guān)的蛋白激酶(DAPK)基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，正向調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。DAPK在許多腫瘤中被證實(shí)其發(fā)揮的是抑制腫瘤細(xì)胞功能。因此，有研究表明，在某些情況下TFCP2可以起到抑制腫瘤的作用[4]。

然而，本研究結(jié)果表明，TFCP2的表達(dá)與腫瘤患者發(fā)生的年齡、性別腫瘤的部位及大小無關(guān)，與腫瘤的分化、浸潤(rùn)深度、侵襲轉(zhuǎn)移、Dukes′分期等密切相關(guān)。通過RT-PCR及Western blot進(jìn)一步證實(shí)TFCP2在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)是顯著高于癌旁結(jié)直腸組織，說明其高表達(dá)可能參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。但其與患者預(yù)后之間的關(guān)系，尚有待以后的隨訪資料來加以明確。結(jié)直腸癌發(fā)生的具體原因及機(jī)制尚未闡明，目前，研究者們更接受FEARON等[13]的大腸癌發(fā)生的經(jīng)典模式，該模式認(rèn)為腫瘤的發(fā)生可能是個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多基因改變從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，包括腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)病基因，微衛(wèi)星不穩(wěn)定，p53基因的突變與缺失等。TFCP2基因曾被認(rèn)為是TP53的前體基因，TFCP2基因與TP53基因在結(jié)直腸癌中的發(fā)生過程中是否有著內(nèi)在的聯(lián)系，尚有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，TFCP2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病理標(biāo)本中顯著高表達(dá)，這提示TFCP2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)展演進(jìn)過程中發(fā)揮重要的作用，可能扮演了促癌的角色。其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，TFCP2的表達(dá)與結(jié)直腸癌分化、Dukes′分期以及侵襲轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的促癌作用。在臨床標(biāo)本中常規(guī)檢測(cè)TFCP2的表達(dá)對(duì)于疾病的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后判斷有重要的提示作用。同時(shí)，通過對(duì)TFCP2的分子調(diào)控機(jī)制研究，可能對(duì)結(jié)直腸癌有重要的科研和臨床指導(dǎo)價(jià)值。