豐富環(huán)境對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區(qū)凋亡蛋白的影響*

李 敏,陶 陶,張繼榮

(1.貴州醫(yī)科大學/貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科,貴陽 550001；2.貴州省人民醫(yī)院康復醫(yī)學科,貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科,貴陽 550001)

腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷是一種病理生理復雜的過程，CIR后的致病機制可能與能力衰竭、細胞內Ca2+水平升高、興奮神經遞質釋放、氧化應激、炎癥等有關。上述機制既相互作用又相互影響，進而促進缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷后梗死灶的形成，神經功能的缺失。腦組織損傷后神經細胞表現為壞死和凋亡，凋亡是I/R損傷最重要的形式。豐富環(huán)境是一種新奇的康復訓練方式，已被應用于基礎研究，例如，腦卒中動物神經功能康復訓練，并且取得良好的訓練效果，但是豐富環(huán)境如何使神經功能得以康復的機制卻少有研究。近期研究發(fā)現，豐富環(huán)境能使腦卒中大鼠神經功能得以恢復，考慮與神經元發(fā)生凋亡有關；豐富環(huán)境可使相關凋亡蛋白表達發(fā)生上調或者下調，使得凋亡減少，從而神經功能得以恢復[1-2]。P53是目前公認促進細胞凋亡的因子，其在腦缺血中的表達調控已成為目前缺血神經元死亡機制中的關鍵環(huán)節(jié)。本研究對豐富環(huán)境下大鼠CIR損傷后缺血半暗帶區(qū)P53蛋白表達進行研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質量250～280 g，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產批號：SCXK(黔)2016-0001。動物使用符合貴州省動物管理委員會管理條例。將大鼠分為假手術組(n=20)、標準環(huán)境模型組(n=20)、豐富環(huán)境模型組(n=20)。

1.1.2主要試劑 直徑18～20 mm的尼龍線栓(北京西濃科技)，Solarbio蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(索來寶公司)，Antin-P53抗體(武漢三鷹)，羅丹明(Rhodamine)標記山抗大鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，免疫熒光試劑盒，TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)，反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)。rat p53 F-GGC TCC GAC TAT ACC ACT ATC CAC TAC，rat p53 R-TTC TTC CTC TGT CCG ACG GTC TC，rat actin F-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA，rat actin R-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA，FastStart Universal SYBR Green Master(發(fā)光)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水。

1.2方法

1.2.1造模 參照Longa法建立大鼠右側大腦中動脈栓塞再灌注損傷模型，具體操作如下：腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位，取頸部正中切口，鈍性分離出右側頸總動脈、右側頸內動脈、右側頸外動脈，在近心端結扎右側頸總動脈，在頸內動脈起始處放置小動脈夾暫時夾閉血流，在頸總動脈剪一小口插入線栓，放開動脈夾將線栓經頸內動脈輕柔插入(插入深度自頸內動脈分叉處約18 cm)，缺血90 min后，再次麻醉大鼠，拔出線栓，縫合頸部切口，即完成大鼠缺血90 min再灌注損傷模型。大鼠蘇醒后觀察其步態(tài)和行為，以判斷模型是否制備成功。假手術組線栓不插入大腦中動脈，其余操作與模型組相同。

1.2.2環(huán)境設置 標準環(huán)境：每只籠子(45 cm×30 cm×20 cm)飼養(yǎng)3只大鼠，予以正常飲食，無玩具飾品等。豐富環(huán)境：大小為150 cm×120 cm×80 cm，鐵鏈和秋千懸于籠中，各種小木塊及各種帶有顏色的小玩具每周更換1次。同時給予聲音及晝夜交替光照刺激。

1.2.3改良神經功能缺失(modified neurological deficit score，mNSS)評分 分別在1、28 d對各組大鼠進行mNSS評分，總分為0～18分，分級如下：0～6分為輕度損傷；7～12分為中度損傷；13～18分為嚴重損傷。分數越高表明行為缺陷更嚴重。

1.2.4石蠟切片制備 將假手術組、標準環(huán)境模型組、豐富環(huán)境模型組各個時間點SD大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，然后梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。

1.2.5HE染色 取各組各時間點石蠟切片，按照Solarbio HE染色試劑盒說明書進行染色。

1.2.6免疫熒光標記法檢測缺血半暗帶區(qū)中P53蛋白表達 取各組各時間點石蠟切片常規(guī)梯度乙醇脫水，0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，每次5 min，檸檬酸鹽緩沖液煮沸，將各組各時間點石蠟切片放入其中，微波爐中高溫加熱20 min，牛血清清蛋白(BSA)封閉液，37 ℃封閉30 min。每張切片滴加一抗(1∶150)，濕盒4 ℃避光孵育過夜，次日取出切片，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，每次5 min，滴加藍色熒光二抗，濕盒內避光孵育1 h，滴加抗熒光猝滅劑，蓋玻片封片，立即置于熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計缺血側梗死灶周邊缺血半暗帶區(qū)200倍視野下熒光陽性細胞數，每張切片取3個互不重疊部位，每份標本取3張切片，用Image J軟件分析。

1.2.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測缺血半暗帶區(qū)P53 mRNA表達 在各時間點將各組大鼠麻醉后斷頭取腦，冰面上快速分離出梗死側大腦半球，進行樣品制備，用Trizol法提取RNA，測量RNA純度，純度在1.8～2.1即可使用，按照反轉錄試劑盒實驗步驟將RNA反轉錄為cDNA，取得各組各時間點cDNA，按照50 μL反應體系分別加入反應混合物(ROX)、前后引物序列、DEPC水、cDNA。設置反應qPCR儀反應條件為：預變性95 ℃ 15 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 15 s，延伸 72 ℃ 20 s,循環(huán)40次；溶解曲線階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。相對基因表達水平為根據ΔCt(ΔΔCt)方法計算如下：目標量=2-ΔΔCt。

2 結 果

2.1mNSS評分結果 假手術組各個時間點mNSS評分均為0分。在第1天時，標準環(huán)境模型組與豐富環(huán)境模型組評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在第28天時，豐富環(huán)境模型組評分(8.00±1.10)分比標準環(huán)境模型組(9.83±1.17)分降低(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與豐富環(huán)境模型組比

圖1mNSS評分結果

2.2HE染色結果 光學顯微鏡下見假手術組神經元結構正常，核仁清晰。標準環(huán)境模型組大鼠見其梗死側腦組織疏松，神經細胞數量減少，形態(tài)呈三角形或扇形，軸突缺失，胞核固縮，核仁消失。梗死中心區(qū)神經元脫失，殘存細胞結構不完整；缺血半暗帶以神經元固縮為主，未見明顯的神經元脫失。豐富環(huán)境模型組在CIR 28 d后神經元病理學改變明顯減輕，缺血半暗帶神經元脫失減輕，周邊皮層神經細胞形態(tài)趨于正常。見圖2。

圖2 各組28 d時HE染色病理切片(×200)

2.3免疫熒光標記法測量缺血半暗帶區(qū)P53蛋白表達結果 假手術組大鼠右側腦組織皮紋下紋狀區(qū)見極弱P53蛋白表達的陽性細胞。再灌注第1天時，標準環(huán)境模型組缺血側腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)出現大量P53陽性細胞，豐富環(huán)境模型組同上述表現。再灌注第28天時，標準環(huán)境模型組(157.42±0.37)缺血側腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)仍有大量P53陽性細胞，但豐富環(huán)境模型組(129.43±0.42)缺血側腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)P53陽性細胞明顯減少。見圖3。

2.4qPCR檢測缺血半暗帶區(qū)P53 mRNA表達 假手術組各個時間點P53 mRNA呈極弱表達。再灌注第1天時，標準環(huán)境模型組及豐富環(huán)境模型組P53 mRNA表達迅速增加；兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；再灌注第28天時，豐富環(huán)境模型組P53 mRNA表達(2.11±0.04)較第1天時明顯下降，但標準環(huán)境模型組(2.36±0.12)較第1天時未見明顯降低，與豐富環(huán)境模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4、5。

圖3 各組各時間點P53蛋白陽性細胞(免疫熒光標記法×200)

A:actin mRNA溶解曲線圖；B：p53 mRNA溶解曲線圖

圖4各組各時間點所測actinmRNA、P53mRNA

a：P<0.01，與豐富環(huán)境模型組比

圖5各組各時間點所測P53mRNA表達比較

3 討 論

豐富環(huán)境已經在大量動物模型中顯示了對大腦發(fā)育和損傷的恢復有好處。與動物研究中的其他康復技術(如約束和特殊肢體訓練)不同，豐富環(huán)境不同的應用，在于它有利于實驗者能夠自愿參與周圍環(huán)境中，且能被無挑戰(zhàn)性活動刺激[3]。大部分研究報告將豐富環(huán)境應用于卒中后的動物，對動物的神經功能和學習能力有增強的功效[4]。在本次實驗中發(fā)現，處于豐富環(huán)境模型組的大鼠，其神經功能缺損改善情況明顯優(yōu)于標準環(huán)境模型組，實驗結果與上述大部分研究報告結果交相呼應。越來越多實驗證據顯示，豐富環(huán)境對腦損傷有著神經保護作用和改善神經功能作用，其作用是通過誘導神經發(fā)生、增加樹突分枝和脊柱密度、促進營養(yǎng)因素的產生和基因表達的變化發(fā)揮的[5-9]。CHEN等[1]通過建立中腦動物閉塞(MCAO)模型調查豐富環(huán)境治療對CIR損傷后周圍皮質神經元凋亡的影響，顯示豐富環(huán)境能改善大鼠神經功能，減少大鼠腦組織梗死灶體積，提高神經元存活率，減少神經細胞凋亡，增加Bcl-2蛋白水平，降低Bax、細胞色素C、Caspase-3表達。推測豐富環(huán)境治療可介導線粒體損傷途徑調控細胞凋亡。

P53是目前公認促進細胞凋亡的因子。P53促進細胞凋亡機制主要以轉錄非依賴信號途徑為主，而非依賴信號途徑最主要的是線粒體途徑。在細胞質中的P53轉錄非依賴活性是通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl或激發(fā)促凋亡蛋白Bax引發(fā)細胞凋亡。這個機制正好與CHEN等[1]的研究相似。P53在腦缺血中的表達調控已成為目前缺血神經元死亡機制中的關鍵環(huán)節(jié)。去除P53基因的腦缺血大鼠，神經細胞凋亡顯著減少，進一步證實了P53蛋白在調控腦缺血后神經細胞凋亡的重要作用[10]。有實驗證實，通過運動預處理的CIR動物模型中P53的表達受到抑制，從而發(fā)揮其腦神經保護作用[11]。徐堅等[12]研究發(fā)現，天麻及電針治療能夠抑制或延遲P53蛋白的表達途徑，使缺血半暗帶區(qū)神經細胞凋亡降低，以便改善局部缺血缺氧、改善微循環(huán)，使腦I/R損傷程度降低。在本實驗mNSS評分結果得出，豐富環(huán)境可以改善I/R損傷后大鼠神經功能缺失癥狀。通過免疫熒光及qPCR結果可以看出，豐富環(huán)境可使缺血半暗帶區(qū)P53表達下降，與徐堅等[12]實驗結果一致，運動預處理、電針均屬于康復方式，豐富環(huán)境也是一種新興的康復訓練方式，積極康復訓練均可使I/R損傷大鼠神經功能得到改善。從微觀促凋亡因子P53表達到大鼠神經功能改善情況，可以大膽推測，I/R損傷后大鼠神經功能改善可能與豐富環(huán)境干預大腦缺血半暗帶區(qū)促凋亡因子P53表達有關。

本實驗探討豐富環(huán)境對SD雄性大鼠CIR損傷后的神經功能缺失癥狀、腦組織內P53表達隨干預時間延長的變化，結果顯示豐富環(huán)境對腦組織低氧應答起保護作用，為臨床上應用豐富環(huán)境治療缺血性腦卒中提供了理論依據。