肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的肝星狀細胞增殖的影響及作用機制研究*

馬曉婷，張石蕾，王志強，陳文龍，由淑萍，劉 濤

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830011)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種常見的慢性肝損傷過程，許多與肝損傷相關(guān)的因素都可以導(dǎo)致HF[1]。在HF病理過程中常出現(xiàn)以下癥狀：肝細胞壞死、結(jié)締組織異常增生、肝循環(huán)紊亂等，最終導(dǎo)致肝硬化繼而引發(fā)肝衰竭[2]。之前的研究報道指出，HF是一種可逆的病理現(xiàn)象，早期預(yù)防或治療HF對慢性肝病的治療有重要意義[3]。目前研究的重點是尋找療效確切、不良反應(yīng)小的藥物，以延緩、抑制甚至逆轉(zhuǎn)HF的進程[4]。一些臨床實踐和試驗研究證明，中醫(yī)藥通過多成分、多路徑、多層次、多目標(biāo)的綜合藥理作用能減緩HF的進程[5-7]。肉蓯蓉是名貴的補益類中藥，分布于中國北部的干旱地區(qū)和沙漠地區(qū)[8]。脂質(zhì)體作為載體在臨床應(yīng)用中具有安全性好、生物相容性好、載藥及靶向效果明確的優(yōu)點，也是最早用于靶向給藥的載體[9]。本研究旨在探討肉蓯蓉苯乙醇總苷(CPhGs)脂質(zhì)體對重組大鼠血小板衍生生長因子(rrPDGF-BB)誘導(dǎo)的肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖的作用，為肝纖維化的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 用薄膜分散二次包封法制備pPB修飾的肉蓯蓉總苷靶向脂質(zhì)體，其粒徑為212.7 nm，電位35～50 mV，包封率(38.46±7.85)%，由本實驗室保存。HSC(中喬新舟)，胎牛血清(美國Gibco公司)，青霉素(美國Hyclone公司)，鏈霉素(美國Hyclone公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS,BI公司)，0.25%胰酶(美國Hyclone公司)，TRIzol Reagent(賽默飛公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(賽默飛公司)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)，PIPA裂解液(賽默飛公司)，蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF，博士德生物)，蛋白定量試劑盒(BioMIGA公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(北京索萊寶公司)，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(北京索萊寶公司)，10×電轉(zhuǎn)液(北京索萊寶公司)，10×TBST(北京索萊寶公司)，無水乙醇(天津大茂化學(xué)試劑廠)，異丙醇(天津富宇精細化工有限公司)，氯仿(天津大茂化學(xué)試劑廠)，甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋)，rrPDGF-BB(R&D公司)，4×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶公司)，兔抗β-actin多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，兔抗p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，兔抗p-p38 MAPK多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代 大鼠HSC在含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞隔日換液，待生長融合至80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，按1∶2進行傳代培養(yǎng)，實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2抑制率為50%時的藥物濃度計算 實驗設(shè)9個CPhGs脂質(zhì)體系列濃度組和1個空白對照組，共10組，每組3個復(fù)孔。CPhGs脂質(zhì)體系列濃度組劑量分別為117.79、58.90、29.45、14.72、7.36、3.68、1.84、0.92和0.46 mg/L。將處于對數(shù)生長期，濃度為5×104/mL的HSC-T6細胞懸液接種于96孔板，每孔添加量為100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察細胞生長狀態(tài)，若貼壁則棄上清液，根據(jù)分組設(shè)計分別更換含117.79、58.90、29.45、14.72、7.36、3.68、1.84、0.92和0.46 mg/LCPhGs脂質(zhì)體的完全培養(yǎng)液和空白完全培養(yǎng)液。加藥后輕晃混勻，放至培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，鏡下觀察細胞狀態(tài)，拿至工作臺，避光，每孔加濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，放至培養(yǎng)箱，4 h后，吸去孔里的液體，每孔加入DMSO 150 μL，于搖床輕晃10 min，用酶標(biāo)儀于492 nm波長測定，記錄吸光度(A)值。計算各復(fù)孔A值能平均值，計算抑制率，以此找尋CphGs脂質(zhì)體的最佳作用濃度。抑制率(%)=(1-各濃度的平均A值)/空白組平均A值×100%)；以CPhGs脂質(zhì)體作用濃度為橫軸，細胞生長抑制率為縱軸，繪制CPhGs脂質(zhì)體作用于HSC-T6的量效反應(yīng)曲線，采用Probit分析計算50%存活率的CPhGs脂質(zhì)體濃度，即為半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3細胞分組 (1)Normal組；(2)rrPDGF-BB組；(3)rrPDGF-BB+29.45 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組；(4)rrPDGF-BB+14.72 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組；(5)rrPDGF-BB+7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組。各組細胞均培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4不同濃度 CPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的影響 大鼠HSC以1×105/mL密度接種至96孔板，待細胞貼壁后進行分組干預(yù)，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入20 μL的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，再向各孔內(nèi)加入150 μL的DMSO，置于搖床室溫搖動10 min，待結(jié)晶充分溶解后，于酶標(biāo)儀492 nm波長處測定A值。抑制率=[(模型組-空白組)-(用藥組-空白組)]/(模型組-空白組)×100%。

1.2.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原和ATF-2的mRNA的表達 Trizol試劑盒提取大鼠HSC總RNA，經(jīng)純度及完整性鑒定后反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書建立qRT-PCR反應(yīng)體系，使用qRT-PCR檢測儀進行檢測。qRT-PCR熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。結(jié)果分析以β-actin為內(nèi)參基因，確定每個樣品、每個基因擴增的循環(huán)閾值(CT)，按照2-△△CT計算目的基因的相對表達水平，所用引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR引物序列

F：正向；R：反向

1.2.6Western blot法分析p-p38蛋白表達水平 收集細胞，運用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取相同質(zhì)量的蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000兔抗p-p38多克隆抗體；1∶1 000兔抗p38多克隆抗體)4 ℃搖床孵育過夜，TBST漂洗3次，二抗(1∶25 000辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)室溫避光孵育1 h，TBST漂洗3次后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影試劑盒曝光顯影。利用圖像分析軟件Image J對條帶進行灰度值的測定，計算分析各組蛋白相對表達水平，以p-p38與p38條帶信號強度的比值表示p-p38蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1GPhGs脂質(zhì)體對HSC的IC50由于CPhGs脂質(zhì)體藥物濃度的遞增，HSC的抑制率隨之增加，當(dāng)CPhGs脂質(zhì)體藥物濃度為117.79 mg/L時，抑制率為(69.09±1.06)%，經(jīng)過Probit分析，CPhGs脂質(zhì)體藥物的IC50為29.06 mg/L，見圖1。

圖1 GPhGs脂質(zhì)體對HSC的IC50

2.2不同時間、不同濃度GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示在24 h時，與Normal組比較，rrPDGF-BB組和不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組A值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，除7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組外，其余濃度CPhGs脂質(zhì)體組A值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在48 h和72 h時，與Nomal組比較，rrPDGF-BB組和不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組A值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組A值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度CPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的影響

a：P<0.05，與Normal組比較，b：P<0.05，與rrPDGF-BB組比較

表3 不同濃度CPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖抑制率的影響%)

a：P<0.05，與rrPDGF-BB+29.45 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組比較，b：P<0.05，與rrPDGF-BB+14.72 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組比較

2.3不同時間、不同濃度GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖抑制的影響 在24 h時，與29.45 mg/L和14.72 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組比較，7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組抑制率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在48 h和72 h與29.45 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組比較，14.72 mg/L和7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組抑制率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與14.72 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組比較，7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組抑制率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC α-SMA、Ⅰ型膠原、ATF-2 mRNA表達的影響 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，與Normal組比較，α-SMA和Ⅰ型膠原基因在rrPDGF-BB組、14.72 mg/L和7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，α-SMA和Ⅰ型膠原基因在不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Normal組比較，ATF-2基因在rrPDGF-BB組和不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，ATF-2基因在不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與Normal組比較，b：P<0.05，與rrPDGF-BB組比較

圖2GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSCα-SMA、Ⅰ型膠原、ATF-2mRNA表達的影響

A:Western blot檢測蛋白條帶；B：Western blot條帶灰度統(tǒng)計分析圖；a：P<0.05，與Normal組比較，b：P<0.05，與rrPDGF-BB組比較;1:Normal組;2:rrPDGF-BB組;3:rrPDGF-BB+29.45 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組;4：rrPDGF-BB+14.72 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組；5：rrPDGF-BB+7.36 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組

圖3GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSCp-p38蛋白表達的影響

2.5GPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC p-p38蛋白表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示，與Normal組比較，p-p38蛋白在rrPDGF-BB組和不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，p-p38蛋白在不同濃度CPhGs脂質(zhì)體組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

HF是世界范圍內(nèi)的健康問題，50%的肝癌患者死于HF[10]。盡管HF發(fā)病率高，但目前尚無有效的治療方法。目前抗HF的治療策略的主要目的是抑制HSC活化和增殖。血小板生長因子(PDGF)-BB存在于肝臟中，對HSC 的增殖有著較強的促進作用，能促進HSC 活化增殖及膠原分泌，是一個高度有效的HSC促有絲分裂原，PDGF與其受體PDGFR結(jié)合形成二聚體后，激活MAPK信號通路，誘導(dǎo)HSC持續(xù)活化；促進HSC遷移、增殖的同時抑制其凋亡[11]。PDGF信號中斷，通過其受體阻斷MAPK信號通路，HSC的增殖和膠原的分泌受到抑制。有學(xué)者在研究羥基紅花黃色素A(HSYA)對HF的作用時發(fā)現(xiàn)，HSYA 對PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC的增殖有明顯的抑制作用[12]。

本研究用50 μg/L的rrPDGF-BB刺激HSC，所有實驗分組在同一刺激因子作用下進行。MTT實驗結(jié)果顯示：CPhGs脂質(zhì)體作用24 h抑制率為10.77%～32.45%，且抑制率與實驗時間和藥物濃度呈線性增加關(guān)系，48 h抑制率為26.50%～50.73%，72 h抑制率為20.75%～54.68%。從實驗結(jié)果可以看出，實驗時間的延長并沒有使抑制率發(fā)生較大的改變，作者認為48 h是藥物的最佳反應(yīng)時間。研究結(jié)果表明，不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體均能抑制HSC的增殖。

任何病因的肝損傷最終都會導(dǎo)致HSC的活化、肌成纖維細胞分化轉(zhuǎn)為HF。也就是說，肌成纖維細胞來自活化和增殖的HSC，且被視為是HF形成的中介[13]。而HSC的活化則是HF的主要過程[14]。活化的HSC通過積累產(chǎn)生ECM，分泌細胞因子，增強趨化能力進而促進肝上皮細胞的再生[15]。在慢性肝病中，HSC的反復(fù)激活導(dǎo)致肝纖維化，其特征是廣泛的瘢痕形成和干擾肝臟正常結(jié)構(gòu)與功能。最近的臨床試驗提示，HF在清除潛在病原體過程中是可逆的[16]。肝損傷后HSC經(jīng)歷一個復(fù)雜的從靜止?fàn)顟B(tài)向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)換或激活過程，其中α-SMA在肌成纖維細胞分化中起作用。α-SMA降低了收縮力和Ⅰ型膠原合成并抑制傷口收縮。Ⅰ型膠原和α-SMA被認為是肝纖維化中誘導(dǎo)HSC活化的標(biāo)志物。在四氯化碳(CCl4)所致的HF研究中發(fā)現(xiàn)，HSC活化過程中α-SMA 和Ⅰ型膠原表達上調(diào)[17]。而最近的研究表明，HSC的活化可以由幾個促有絲分裂原推動，包括PDGF、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)[18]和結(jié)締組織生長因子(CTGF)[19]。在關(guān)于TRPM7通道調(diào)節(jié)PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的研究數(shù)據(jù)表明，TRPM7可降低α-SMA和Ⅰ型膠原的表達，抑制HF[20]。ATF-2參與多條信號通路的傳導(dǎo)，同時在肝組織表達的ATF-2的堿基在p38磷酸化后出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性和DNA結(jié)合的增加。本研究探討不同濃度CPhGs脂質(zhì)體對rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的影響。qRT-PCR擴增檢測α-SMA、Ⅰ型膠原、ATF-2 mRNA結(jié)果提示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組α-SMA、Ⅰ型膠原、ATF-2 mRNA表達明顯增高；與rrPDGF-BB組相比，不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體均可不同程度下調(diào)α-SMA、Ⅰ型膠原、ATF-2 mRNA表達，其中29.45 mg/L CPhGs脂質(zhì)體組下調(diào)作用最明顯，α-SMA,Ⅰ型膠原mRNA與Normal組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異，作者認為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因在于濃度越高，其對rrPDGF-BB引起的HSC增殖的抑制效果越明顯，越趨近于正常。作者認為CPhGs脂質(zhì)體能有效抑制rrPDGF-BB刺激的HSC中Ⅰ型膠原和ATF-2 mRNA表達、下調(diào)α-SMA mRNA表達，進而減少ECM合成與分泌，阻止HF的形成。

此外，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其子系統(tǒng)p38通路參與HSC的活化，因而可能成為治療HF的靶點。p38 MAPK是MAPK家族成員之一，p38是由各種刺激引起的許多細胞的傳感器，且在調(diào)節(jié)棕色脂肪細胞、肌肉細胞和肝細胞的能量平衡過程中起著重要的作用，p38 MAPK也被認為在調(diào)節(jié)炎性因子方面扮演重要角色。因此，p38 MAPK激活可能在HSC損傷與炎癥過程中發(fā)揮作用。研究證明PDGF-BB可通過MAPK信號通路誘導(dǎo)HSC細胞活化與增殖[21]。梔子苷可抑制p-p38蛋白的表達從而起到抑制HF的作用[22]。本研究結(jié)果顯示，與Normal組比較，rrPDGF-BB組p-p38的蛋白表達水平明顯增高，表明rrPDGF-BB可通過影響MAPK信號而使HSC活化增殖。不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體組，p-p38的蛋白表達水平隨著藥物濃度的升高逐漸降低，且將不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體組p-p38的蛋白表達水平與rrPDGF-BB組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，CPhGs脂質(zhì)體可在一定程度上抑制rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖與活化，從而抑制HF的形成。當(dāng)前，對HF的了解較少，全新的方法及技術(shù)手段將會對HF進行深入研究，從而對干預(yù)、早期診斷和治療HF提供全新的治療策略。