轉(zhuǎn)扁桃AcCBF1基因?qū)煵莨夂霞叭~綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2019-05-30 02:16:38張琦，李鵬，田嘉，李疆
新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期
張 琦，李 鵬，田 嘉，李 疆
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052)
0 引 言
【研究意義】扁桃(AmygdaluscommunisL.)是四大干果樹種之一，種仁營養(yǎng)價(jià)值豐富，加工產(chǎn)品多種多樣[1-3]。我國栽培扁桃主要分布在新疆喀什地區(qū)莎車縣、英吉沙縣及其周邊地區(qū)[4]，目前栽培扁桃面積約7.5×104hm2，年產(chǎn)量約6×104t我國新疆自產(chǎn)扁桃遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場需求[5]，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國2017年進(jìn)口帶殼扁桃約7×104t，進(jìn)口扁桃約9×104t[6]。我國扁桃平均單株產(chǎn)量較低(約5 kg)，僅是美國加州扁桃平均單株產(chǎn)量的1/5～1/3，這與我國新疆地區(qū)冬季較嚴(yán)寒、春季多霜凍、夏季炎熱干旱有很大的關(guān)系，選育抗逆性較強(qiáng)，產(chǎn)量穩(wěn)定的扁桃新品種迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物CBF及其家族基因參與調(diào)控植物抗寒、抗旱、抗鹽堿等多種生理過程[7-8]，在光合作用[9]、水分運(yùn)輸[10]、激素(IAA、GA、SA、BR)代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]中發(fā)揮重要調(diào)控作用。扁桃中研究發(fā)現(xiàn)CBF基因在逆境中起作用，如AlsCBF[12]、SG-AcCBF1[13]、AcCBF2[14]均受干旱、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】光合作用為植物的生長發(fā)育提供源源不斷的碳水化合物，與植物生長息息相關(guān)[15]。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)反應(yīng)技術(shù)可檢測光合作用“內(nèi)在性”指標(biāo)[16]，通過分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，有助于快速了解PSⅡ系統(tǒng)對光吸收、傳遞、耗散和分配等過程，直接或間接反映植物光合能力和抗逆能力[17,18]。目前國內(nèi)外對CBF及其家族基因的研究多集中在低溫脅迫、鹽堿脅迫等，對CBF基因在光合作用中的研究較少。研究轉(zhuǎn)扁桃AcCBF1基因煙草光合及葉綠素?zé)晒馓匦?。【擬解決關(guān)鍵問題】試驗(yàn)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)扁桃AcCBF1基因煙草，在經(jīng)過連續(xù)室外37℃高溫天氣一周后，以野生煙草為對照，對其光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定分析，分析扁桃AcCBF1基因?qū)夂献饔玫挠绊?，為選育抗逆性較強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定的扁桃新品種提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材 料
塞姆氏煙草(NicotianatabacumL.)，pCAMBIA1304-AcCBF1甘油菌及質(zhì)粒均由實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒購于北京全式金公司；頭孢噻肟鈉(Cefotaxime sodium，Cef)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampicin，Rif)、DNA Maker D 2000均購自上海生工生物工程有限公司；乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)購自Biosharp生物科技公司；引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 方 法
1.2.1 轉(zhuǎn)扁桃AcCBF1基因煙草植株獲得
1.2.1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
參照晁朝霞[19]的方法進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化煙草。表1
表1AcCBF1、Hyg、GUS片段擴(kuò)增引物序列
Table 1 Primer sequence amplified byAcCBF1,Hyg,GUSfragment
名稱Name序列OrderGUS-F5’-AGACTATCCCGCCGGGAATGG-3’GUS-R5’-GCGGTGATACATATCCAGCCA-3’AcCBF1-F5’-CGGAATTCATGAACAGGTTCTTCTCTCATTT-3’AcCBF1-R5’-CGGGATCCTTAATTGGAGAAACTCCACAATT-3’Hyg-F5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’Hyg-R5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’
1.2.1.2 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定
采用CTAB法[20]提取煙草DNA。轉(zhuǎn)AcCBF1基因植株采用三對引物(AcCBF1基因引物、GUS基因引物、Hyg引物)進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.2 光合特性
參照韓拓[21]、?，摤揫22]等方法。在經(jīng)過連續(xù)室外37℃高溫天氣一周后，于2018年8月16日，晴天無云，從08：00～20：00，每2 h使用GFS-3000便攜式光合作用測定儀(德國WALZ公司)測定成熟功能葉的凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs、蒸騰速率Tr、胞間CO2濃度Ci。分別選取3株長勢一致且無病蟲害的轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草，每株取3片葉子進(jìn)行標(biāo)記和測定，每個葉片測定3次。
1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)
參照?，摤揫22]、劉衛(wèi)群[23]等方法。使用FMS-2便攜脈沖調(diào)制式熒光儀(英國Hansatech公司)進(jìn)行測定已標(biāo)記葉片的初始熒光Fo、最大熒光Fm等參數(shù)，并計(jì)算可變熒光Fv(Fv = Fm-Fo)最大光能效率Fv/Fm、PSII潛在活性Fv/Fo、PSII實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSII。
1.3 數(shù)據(jù)處理
利用Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，Excel 2003進(jìn)行繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草
2.1.1 菌液PCR
采用凍融法將pCAMBIA1304-AcCBF1甘油菌進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行活化后進(jìn)行菌液PCR檢測，1%凝膠電泳，3條目的基因條帶(GUS基因目的條帶為1 081 bp，Hyg基因目的條帶為556 bp，AcCBF1基因目的條帶為750 bp左右)明亮清晰，侵染所用菌液準(zhǔn)確可靠。圖1
M：DL2000 Marker；1：GUS基因引物PCR產(chǎn)物；2：AcCBF1基因引物PCR產(chǎn)物；3：Hyg基因引物PCR產(chǎn)物
M: DL2000 Marker; 1:GUSgene primer PCR product; 2:AcCBF1 gene primer PCR product; 3:Hyggene primer PCR product
圖1 菌液PCR鑒定
Fig.1 PCR identification of bacteria liquid
2.1.2 轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草的獲得
煙草葉盤經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約20 d左右，葉盤邊緣出現(xiàn)愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)至分化出抗性芽，待抗性芽長至2～3 cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，30 d左右根系發(fā)育健全；待抗性苗長至3～4片葉時，揭開蓋子2～3 d進(jìn)行煉苗，洗去培養(yǎng)基，將抗性苗移栽至裝有無菌土的花盆中進(jìn)行培育。圖2
A：預(yù)培養(yǎng)葉盤；B：共生葉盤；C：抗性芽；D：再生植株生根
A: Pre-cultured leaves ; B: Col-cultured leaves; C: Regenerate buds; D: The root of regenerated plant.
圖2 煙草抗性芽的篩選及再生植株獲得
Fig.2 Selection of tobacco resistant buds and regenerated tobacco plants
2.1.3 轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草的鑒定
采用改良后的CTAB法提取煙草DNA，通過AcCBF1基因、GUS基因、Hyg基因3對引物進(jìn)行PCR鑒定，3對引物同時擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的抗性植株為轉(zhuǎn)AcCBF1植株，經(jīng)篩選獲得三株轉(zhuǎn)AcCBF1煙草植株。圖3
M：DL2000 Marker；1～5：GUS基因引物PCR產(chǎn)物；1～3：轉(zhuǎn)基因煙草植株；4：野生煙草植株；5：pCAMBIA1304-AcCBF1質(zhì)粒；6～10：AcCBF1基因引物PCR產(chǎn)物；6～8：轉(zhuǎn)基因煙草植株；9：野生煙草植株；10：11～15：Hyg基因引物PCR產(chǎn)物；11～13：轉(zhuǎn)基因煙草植株；14：野生煙草植株；15：pCAMBIA1304-AcCBF1質(zhì)粒
M: DL2000 Marker; 1-5:GUSprimer PCR products; 1-3: transgenic tobacco plants; 4: wild tobacco plants; 5: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 6-10:AcCBF1 gene primer PCR products; 6-8: transgenic tobacco plants; 9: wild tobacco plants; 10: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 11-15:Hygprimer PCR products; 11-13: transgenic tobacco plants; 14: wild tobacco plants; 15: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmids
圖3 轉(zhuǎn)AcCBF1煙草植株鑒定
Fig.3 Plant Identification of transgenic Tobacco withAcCBF1
2.2 光合參數(shù)日變化規(guī)律
2.2.1 凈光合速率(Pn)日變化
兩種煙草的Pn日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Pn在12:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn值分別為11.434 、8.714 μ mol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Pn值分別為3.014 、2.529 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Pn值分別為4.295、3.779 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn日均值分別為6.496 、4.553 μmol/(m2·s)。圖4
圖4 凈光合速率日變化
Fig.4 Diurnal variation of net photosynthetic rate
2.2.2 氣孔導(dǎo)度(Gs)日變化
兩種煙草的Gs日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Gs在12:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Gs值分別為223.695 、197.693 μmol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Gs值分別為143.348 、124.411 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Gs值分別為151.377、141.973 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Gs日均值分別為157.357 、133.371 μmol/(m2·s)。圖5
圖5 氣孔導(dǎo)度日變化
Fig.5 Diurnal variation of stomatal conductance
2.2.3 蒸騰速率(Tr)日變化
兩種煙草的Tr日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Tr在14:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Tr值分別為3.655 μmol/(m2·s)、4.618 μmol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Tr值分別為2.083μmol/(m2·s)、2.328 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Tr值分別為2.851 μmol/(m2·s)、3.078 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Tr日均值分別為2.198 μmol/(m2·s)、2.670 μmol/(m2·s)。圖6
圖6 蒸騰速率日變化
Fig.6 Diurnal variation of transpiration rate
2.2.4 胞間CO2濃度(Ci)日變化
兩種煙草的Ci日變化與Pn、Gs剛好相反。Ci在12:00達(dá)到第一個谷值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Ci值分別為167.173 、193.159 μ mol/mol；16:00出現(xiàn)光和“午休”，二者Ci值分別為228.369 、245.689 μmol/mol；18:00達(dá)到第二個谷值，二者Ci值分別為198.086、209.022 μmol/mol。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Ci日均值分別為231.879 、253.096 μmol/mol。圖7
圖7 胞間CO2濃度日變化
Fig.7 Diurnal variation of intercellular CO2concentration
2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化規(guī)律
2.3.1 Fo和Fm的日變化
轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Fo均呈現(xiàn)出先上升后下降的日變化趨勢，在16:00時升至最高。兩種煙草的峰值分別為177.667、246.667，日均值分別為144.333、176.333，轉(zhuǎn)基因煙草的Fo低于野生煙草。Fm呈現(xiàn)先下降后上升的日變化趨勢，在16:00時降至最低。兩種煙草的最低值分別為662.667、526.333，日均值分別為825、723.523，轉(zhuǎn)基因煙草的Fm高于野生煙草。圖8、圖9
圖8 Fo日變化
Fig.8 Diurnal variation of Fo
圖9 Fm日變化
Fig.9 Diurnal variation of Fm
2.3.2 Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日變化
兩種煙草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均呈現(xiàn)先下降后上升的日變化趨勢，在16:00時降至最低。Fv/Fm最低值分別為0.732、0.531，日均值分別為0.821、0.736；Fv/Fo最低值分別2.739、1.135，日均值分別為5.044、3.391；ΦPSII最低值分別為0.563、0.239，日均值分別為0.763、0.600，轉(zhuǎn)基因煙草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均高于野生煙草。圖10～12
圖10 Fv/Fm日變化
Fig.10 Diurnal variation of Fv/Fm
圖11 Fv/Fo日變化
Fig.11 Diurnal variation of Fv/Fo
圖12 ΦPSII日變化
Fig.12 Diurnal variation of ΦPSII
3 討論
葉片通過光合作用將光能、CO2、水等轉(zhuǎn)化為具有能量的有機(jī)物以滿足生長發(fā)育需要，是植物體內(nèi)最基本、最復(fù)雜的生理過程[15]。Pn是衡量植物光合作用的主要指標(biāo)，直接反映植物葉片光合能力強(qiáng)弱；Gs是指植物氣孔與外界交換氣體，調(diào)控水分消耗能力；植物胞間CO2是植物光合作用過程中碳源的主要來源[23]。Gs的大小、Ci的高低直接影響植物凈光合速率[24,25]。研究表明，多數(shù)植物在夏季高溫時會出現(xiàn)光合“午休”現(xiàn)象[9,22,24-26]。Farquhar等[27]針對這一現(xiàn)象提出，若Pn、Gs、Ci同時降低，“午休”現(xiàn)象主要由氣孔限制因素造成；若Pn、Gs同時降低，Ci上升，“午休”現(xiàn)象主要由非氣孔限制因素造成。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn、Gs日變化均呈“雙峰”曲線，在午間高溫強(qiáng)光時段兩者均出現(xiàn)主要由非氣孔限制因素導(dǎo)致的光合“午休”現(xiàn)象，這與胡亞杰[9]的研究一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比野生煙草而言，轉(zhuǎn)基因煙草的Pn、Gs較高，Tr、Ci較低，這與劉衛(wèi)群等[21]、胡亞杰[9]等的研究結(jié)果有所差異，他們的試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)BnDREB1-5基因煙草的Pn、Gs、Tr、Ci均小于野生煙草。
植物在午間高溫強(qiáng)光時段，葉片光合機(jī)構(gòu)往往不能完全利用它所吸收的光能，造成光合效率下降，此類現(xiàn)象被稱為光抑制，光抑制是非氣孔限制因素的主要形式[28]。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)能夠有效地探測植物光合反應(yīng)中心的運(yùn)行狀態(tài)[16,26-27]，F(xiàn)o的變化是判斷PSII反應(yīng)中心是否受破壞或失活的直接證據(jù)，F(xiàn)o上升可能是由于植物葉片PSII反應(yīng)中心受到破壞或失活；Fo下降可能由于植物葉片通過增加PSⅡ天線的熱耗散，來消耗掉未被利用的光能以保護(hù)光合反應(yīng)中心不受影響[16,26,28,30]。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII降低通常是判斷植物在逆境脅迫下遭受光抑制的顯著特征，可作為反映脅迫程度的理想指標(biāo)[28-32]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)o日變化呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，F(xiàn)m、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日變化呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，均在16:00時到達(dá)峰值或谷值，表明兩種煙草在逆境條件下均受到光抑制，PSII反應(yīng)中心捕獲光能效率降低，出現(xiàn)可逆失活，并未遭到破壞，這與胡亞杰[9]、鐘敏等[26]、劉衛(wèi)群等[23]、趙躍鋒等[31]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草Fo的上升幅度及Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII的下降幅度都小于野生煙草，表明轉(zhuǎn)基因煙草的PSII反應(yīng)中心相對穩(wěn)定；Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII較高，轉(zhuǎn)基因煙草能將吸收的光能更有效地利用到光合作用中，這與劉衛(wèi)群等[23]研究一致。
4 結(jié) 論
煙草受到高溫強(qiáng)光的影響，葉片光合反應(yīng)中心出現(xiàn)可逆失活，造成由光抑制的非氣孔限制因素迫使煙草凈光合速率下降。與野生煙草相比，轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草同化CO2能力較高，光合能力較強(qiáng)，光合反應(yīng)中心較穩(wěn)定，對高溫的適應(yīng)能力較強(qiáng)。扁桃AcCBF1基因能夠有效改善煙草的光合作用，維護(hù)光合反應(yīng)中心的穩(wěn)定；通過選育逆境下扁桃AcCBF1高表達(dá)品種來應(yīng)對夏季的干旱高溫。
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1 材料與方法
1.1 材 料
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1.2 方 法
1.2.1 轉(zhuǎn)扁桃AcCBF1基因煙草植株獲得
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表1AcCBF1、Hyg、GUS片段擴(kuò)增引物序列
Table 1 Primer sequence amplified byAcCBF1,Hyg,GUSfragment
名稱Name序列OrderGUS-F5’-AGACTATCCCGCCGGGAATGG-3’GUS-R5’-GCGGTGATACATATCCAGCCA-3’AcCBF1-F5’-CGGAATTCATGAACAGGTTCTTCTCTCATTT-3’AcCBF1-R5’-CGGGATCCTTAATTGGAGAAACTCCACAATT-3’Hyg-F5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’Hyg-R5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’
1.2.1.2 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定
采用CTAB法[20]提取煙草DNA。轉(zhuǎn)AcCBF1基因植株采用三對引物(AcCBF1基因引物、GUS基因引物、Hyg引物)進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.2 光合特性
參照韓拓[21]、?，摤揫22]等方法。在經(jīng)過連續(xù)室外37℃高溫天氣一周后，于2018年8月16日，晴天無云，從08：00～20：00，每2 h使用GFS-3000便攜式光合作用測定儀(德國WALZ公司)測定成熟功能葉的凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs、蒸騰速率Tr、胞間CO2濃度Ci。分別選取3株長勢一致且無病蟲害的轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草，每株取3片葉子進(jìn)行標(biāo)記和測定，每個葉片測定3次。
1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)
參照?，摤揫22]、劉衛(wèi)群[23]等方法。使用FMS-2便攜脈沖調(diào)制式熒光儀(英國Hansatech公司)進(jìn)行測定已標(biāo)記葉片的初始熒光Fo、最大熒光Fm等參數(shù)，并計(jì)算可變熒光Fv(Fv = Fm-Fo)最大光能效率Fv/Fm、PSII潛在活性Fv/Fo、PSII實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSII。
1.3 數(shù)據(jù)處理
利用Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，Excel 2003進(jìn)行繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草
2.1.1 菌液PCR
采用凍融法將pCAMBIA1304-AcCBF1甘油菌進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行活化后進(jìn)行菌液PCR檢測，1%凝膠電泳，3條目的基因條帶(GUS基因目的條帶為1 081 bp，Hyg基因目的條帶為556 bp，AcCBF1基因目的條帶為750 bp左右)明亮清晰，侵染所用菌液準(zhǔn)確可靠。圖1
M：DL2000 Marker；1：GUS基因引物PCR產(chǎn)物；2：AcCBF1基因引物PCR產(chǎn)物；3：Hyg基因引物PCR產(chǎn)物
M: DL2000 Marker; 1:GUSgene primer PCR product; 2:AcCBF1 gene primer PCR product; 3:Hyggene primer PCR product
圖1 菌液PCR鑒定
Fig.1 PCR identification of bacteria liquid
2.1.2 轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草的獲得
煙草葉盤經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約20 d左右，葉盤邊緣出現(xiàn)愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)至分化出抗性芽，待抗性芽長至2～3 cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，30 d左右根系發(fā)育健全；待抗性苗長至3～4片葉時，揭開蓋子2～3 d進(jìn)行煉苗，洗去培養(yǎng)基，將抗性苗移栽至裝有無菌土的花盆中進(jìn)行培育。圖2
A：預(yù)培養(yǎng)葉盤；B：共生葉盤；C：抗性芽；D：再生植株生根
A: Pre-cultured leaves ; B: Col-cultured leaves; C: Regenerate buds; D: The root of regenerated plant.
圖2 煙草抗性芽的篩選及再生植株獲得
Fig.2 Selection of tobacco resistant buds and regenerated tobacco plants
2.1.3 轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草的鑒定
采用改良后的CTAB法提取煙草DNA，通過AcCBF1基因、GUS基因、Hyg基因3對引物進(jìn)行PCR鑒定，3對引物同時擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的抗性植株為轉(zhuǎn)AcCBF1植株，經(jīng)篩選獲得三株轉(zhuǎn)AcCBF1煙草植株。圖3
M：DL2000 Marker；1～5：GUS基因引物PCR產(chǎn)物；1～3：轉(zhuǎn)基因煙草植株；4：野生煙草植株；5：pCAMBIA1304-AcCBF1質(zhì)粒；6～10：AcCBF1基因引物PCR產(chǎn)物；6～8：轉(zhuǎn)基因煙草植株；9：野生煙草植株；10：11～15：Hyg基因引物PCR產(chǎn)物；11～13：轉(zhuǎn)基因煙草植株；14：野生煙草植株；15：pCAMBIA1304-AcCBF1質(zhì)粒
M: DL2000 Marker; 1-5:GUSprimer PCR products; 1-3: transgenic tobacco plants; 4: wild tobacco plants; 5: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 6-10:AcCBF1 gene primer PCR products; 6-8: transgenic tobacco plants; 9: wild tobacco plants; 10: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 11-15:Hygprimer PCR products; 11-13: transgenic tobacco plants; 14: wild tobacco plants; 15: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmids
圖3 轉(zhuǎn)AcCBF1煙草植株鑒定
Fig.3 Plant Identification of transgenic Tobacco withAcCBF1
2.2 光合參數(shù)日變化規(guī)律
2.2.1 凈光合速率(Pn)日變化
兩種煙草的Pn日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Pn在12:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn值分別為11.434 、8.714 μ mol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Pn值分別為3.014 、2.529 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Pn值分別為4.295、3.779 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn日均值分別為6.496 、4.553 μmol/(m2·s)。圖4
圖4 凈光合速率日變化
Fig.4 Diurnal variation of net photosynthetic rate
2.2.2 氣孔導(dǎo)度(Gs)日變化
兩種煙草的Gs日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Gs在12:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Gs值分別為223.695 、197.693 μmol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Gs值分別為143.348 、124.411 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Gs值分別為151.377、141.973 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Gs日均值分別為157.357 、133.371 μmol/(m2·s)。圖5
圖5 氣孔導(dǎo)度日變化
Fig.5 Diurnal variation of stomatal conductance
2.2.3 蒸騰速率(Tr)日變化
兩種煙草的Tr日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)“雙峰”曲線，且兩次峰值出現(xiàn)時間一致。Tr在14:00達(dá)到第一個峰值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Tr值分別為3.655 μmol/(m2·s)、4.618 μmol/(m2·s)；16:00出現(xiàn)光合“午休”，二者Tr值分別為2.083μmol/(m2·s)、2.328 μmol/(m2·s)；18:00達(dá)到第二個峰值，二者Tr值分別為2.851 μmol/(m2·s)、3.078 μmol/(m2·s)。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Tr日均值分別為2.198 μmol/(m2·s)、2.670 μmol/(m2·s)。圖6
圖6 蒸騰速率日變化
Fig.6 Diurnal variation of transpiration rate
2.2.4 胞間CO2濃度(Ci)日變化
兩種煙草的Ci日變化與Pn、Gs剛好相反。Ci在12:00達(dá)到第一個谷值，轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Ci值分別為167.173 、193.159 μ mol/mol；16:00出現(xiàn)光和“午休”，二者Ci值分別為228.369 、245.689 μmol/mol；18:00達(dá)到第二個谷值，二者Ci值分別為198.086、209.022 μmol/mol。轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Ci日均值分別為231.879 、253.096 μmol/mol。圖7
圖7 胞間CO2濃度日變化
Fig.7 Diurnal variation of intercellular CO2concentration
2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化規(guī)律
2.3.1 Fo和Fm的日變化
轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Fo均呈現(xiàn)出先上升后下降的日變化趨勢，在16:00時升至最高。兩種煙草的峰值分別為177.667、246.667，日均值分別為144.333、176.333，轉(zhuǎn)基因煙草的Fo低于野生煙草。Fm呈現(xiàn)先下降后上升的日變化趨勢，在16:00時降至最低。兩種煙草的最低值分別為662.667、526.333，日均值分別為825、723.523，轉(zhuǎn)基因煙草的Fm高于野生煙草。圖8、圖9
圖8 Fo日變化
Fig.8 Diurnal variation of Fo
圖9 Fm日變化
Fig.9 Diurnal variation of Fm
2.3.2 Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日變化
兩種煙草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均呈現(xiàn)先下降后上升的日變化趨勢，在16:00時降至最低。Fv/Fm最低值分別為0.732、0.531，日均值分別為0.821、0.736；Fv/Fo最低值分別2.739、1.135，日均值分別為5.044、3.391；ΦPSII最低值分別為0.563、0.239，日均值分別為0.763、0.600，轉(zhuǎn)基因煙草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均高于野生煙草。圖10～12
圖10 Fv/Fm日變化
Fig.10 Diurnal variation of Fv/Fm
圖11 Fv/Fo日變化
Fig.11 Diurnal variation of Fv/Fo
圖12 ΦPSII日變化
Fig.12 Diurnal variation of ΦPSII
3 討論
葉片通過光合作用將光能、CO2、水等轉(zhuǎn)化為具有能量的有機(jī)物以滿足生長發(fā)育需要，是植物體內(nèi)最基本、最復(fù)雜的生理過程[15]。Pn是衡量植物光合作用的主要指標(biāo)，直接反映植物葉片光合能力強(qiáng)弱；Gs是指植物氣孔與外界交換氣體，調(diào)控水分消耗能力；植物胞間CO2是植物光合作用過程中碳源的主要來源[23]。Gs的大小、Ci的高低直接影響植物凈光合速率[24,25]。研究表明，多數(shù)植物在夏季高溫時會出現(xiàn)光合“午休”現(xiàn)象[9,22,24-26]。Farquhar等[27]針對這一現(xiàn)象提出，若Pn、Gs、Ci同時降低，“午休”現(xiàn)象主要由氣孔限制因素造成；若Pn、Gs同時降低，Ci上升，“午休”現(xiàn)象主要由非氣孔限制因素造成。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的Pn、Gs日變化均呈“雙峰”曲線，在午間高溫強(qiáng)光時段兩者均出現(xiàn)主要由非氣孔限制因素導(dǎo)致的光合“午休”現(xiàn)象，這與胡亞杰[9]的研究一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比野生煙草而言，轉(zhuǎn)基因煙草的Pn、Gs較高，Tr、Ci較低，這與劉衛(wèi)群等[21]、胡亞杰[9]等的研究結(jié)果有所差異，他們的試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)BnDREB1-5基因煙草的Pn、Gs、Tr、Ci均小于野生煙草。
植物在午間高溫強(qiáng)光時段，葉片光合機(jī)構(gòu)往往不能完全利用它所吸收的光能，造成光合效率下降，此類現(xiàn)象被稱為光抑制，光抑制是非氣孔限制因素的主要形式[28]。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)能夠有效地探測植物光合反應(yīng)中心的運(yùn)行狀態(tài)[16,26-27]，F(xiàn)o的變化是判斷PSII反應(yīng)中心是否受破壞或失活的直接證據(jù)，F(xiàn)o上升可能是由于植物葉片PSII反應(yīng)中心受到破壞或失活；Fo下降可能由于植物葉片通過增加PSⅡ天線的熱耗散，來消耗掉未被利用的光能以保護(hù)光合反應(yīng)中心不受影響[16,26,28,30]。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII降低通常是判斷植物在逆境脅迫下遭受光抑制的顯著特征，可作為反映脅迫程度的理想指標(biāo)[28-32]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)o日變化呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，F(xiàn)m、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日變化呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，均在16:00時到達(dá)峰值或谷值，表明兩種煙草在逆境條件下均受到光抑制，PSII反應(yīng)中心捕獲光能效率降低，出現(xiàn)可逆失活，并未遭到破壞，這與胡亞杰[9]、鐘敏等[26]、劉衛(wèi)群等[23]、趙躍鋒等[31]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草Fo的上升幅度及Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII的下降幅度都小于野生煙草，表明轉(zhuǎn)基因煙草的PSII反應(yīng)中心相對穩(wěn)定；Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII較高，轉(zhuǎn)基因煙草能將吸收的光能更有效地利用到光合作用中，這與劉衛(wèi)群等[23]研究一致。
4 結(jié) 論
煙草受到高溫強(qiáng)光的影響，葉片光合反應(yīng)中心出現(xiàn)可逆失活，造成由光抑制的非氣孔限制因素迫使煙草凈光合速率下降。與野生煙草相比，轉(zhuǎn)AcCBF1基因煙草同化CO2能力較高，光合能力較強(qiáng)，光合反應(yīng)中心較穩(wěn)定，對高溫的適應(yīng)能力較強(qiáng)。扁桃AcCBF1基因能夠有效改善煙草的光合作用，維護(hù)光合反應(yīng)中心的穩(wěn)定；通過選育逆境下扁桃AcCBF1高表達(dá)品種來應(yīng)對夏季的干旱高溫。
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