成年大鼠脊髓損傷模型音猬因子的表達研究

音猬因子是胚胎發(fā)育過程中脊索產(chǎn)生的一種神經(jīng)調(diào)控因子，其對神經(jīng)管腹側(cè)結(jié)構(gòu)的形成、發(fā)育與分化有所影響[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，音猬因子在神經(jīng)軸突損傷后修復(fù)和再生過程中有活躍表現(xiàn)，并且在很多神經(jīng)性疾病中音猬因子信號也有重要作用，有實驗證實音猬因子信號可以對瀕死的神經(jīng)元具有顯著的營養(yǎng)和保護作用來延緩神經(jīng)元壞死等[2-3]。為進一步探討音猬因子表達和神經(jīng)損傷以及神經(jīng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)性展開本組研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源：從實驗室飼養(yǎng)大鼠中選取30只符合納入標(biāo)準(zhǔn)的成年大鼠為研究對象，均為常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)的健康大鼠。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為成年健康大鼠，體質(zhì)量220～250 g。②雌雄不限。

1.3 處理方法：將30只大鼠分為兩組，其中5只僅咬除椎板作為空白組，其余25只制作脊髓損傷模型。造模方法：25只大鼠按照標(biāo)準(zhǔn)0.3 mL/100 g腹部注射10%水合氯醛；參考Allen's打擊法進行脊髓損傷模型制作，麻醉完成后大鼠取俯臥位并固定四肢，影像學(xué)設(shè)備輔助下確定大鼠脊髓T10節(jié)段，做縱向切口，使皮下組織、筋膜、肌肉、棘突暴露，使用咬骨鉗咬除T10節(jié)段對應(yīng)棘突和椎板，并制作圓形骨窗，使脊髓硬膜囊暴露。使用墊片覆蓋T10脊髓，從25 mm高度自由落下重10 g克氏針對脊髓進行沖擊，形成損傷。觀察到對應(yīng)部位出現(xiàn)充血、水腫且下肢迅速回縮、尾巴翹起、大鼠迅速倒下時則可認定為脊髓損傷模型制作完成。

1.4 行為學(xué)評估：分別于模型制作完成后第1、3、5、7、14天時取5只大鼠進行行為學(xué)評估。主要觀察項目為大鼠脊髓損傷后不同時間點肢體功能恢復(fù)情況，以此為依據(jù)評估脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況。采用BBB評分和斜板試驗進行行為評估，斜板試驗為使大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直后不斷調(diào)整斜板坡度，以大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大坡度為其肢體功能評分。

1.5 音猬因子檢測方法：使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測音猬因子表達，顯微鏡下檢測脊髓組織免疫組化染色后音猬因子的表達。音猬因子mRNA檢測及半定量采用原位雜交技術(shù)。利用高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)對音猬因子表達進行圖像分析，選取視野內(nèi)陽性反應(yīng)細胞并進行半定量分析。根據(jù)原位雜交信號強度和分布情況確定4個等級，分別為無信號（-）、低信號（+）、中等信號（++）、高信號（+++）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：使用SPSS14.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評估：脊髓損傷模型下的5只大鼠出現(xiàn)不同程度的后肢力量減弱、行走緩慢、步態(tài)異常，與空白組比較存在差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進行行為學(xué)評估結(jié)果（

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進行行為學(xué)評估結(jié)果（

脊髓損傷組斜板試驗評分脊髓損傷第1天 21 1.1±0.2 65.0±4.1 32.1±3.5脊髓損傷第3天 21 2.1±0.3 65.1±3.6 34.3±3.6脊髓損傷第5天 21 2.6±0.4 65.3±3.2 36.2±3.9脊髓損傷第7天 21 3.2±0.5 65.7±3.9 38.8±4.2脊髓損傷第14天 21 6.1±0.7 65.8±3.8 42.9±4.5組別 空白組BBB評分脊髓損傷組BBB評分空白組斜板試驗評分

根據(jù)表中統(tǒng)計結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠BBB評分和斜板試驗評分隨時間推移整體變化值較小，而脊髓損傷模型大鼠的對應(yīng)評分則隨著時間推移不斷改善，這提示隨著時間的推移脊髓損傷模型下的成年大鼠脊髓功能逐漸恢復(fù)。

2.2 音猬因子表達檢測結(jié)果：通過免疫組化檢查，脊髓損傷模型后第3天觀察到音猬因子蛋白開始表達。脊髓損傷模型制作第1天后，取5只成年大鼠進行音猬因子mRNA檢測，發(fā)現(xiàn)可見音猬因子表達低信號，范圍較為局限，僅在脊髓灰質(zhì)區(qū)域內(nèi)，白質(zhì)區(qū)域內(nèi)未檢測到音猬因子mRNA，表達信號為-。脊髓損傷模型制作第3天后，取5只成年大鼠進行音猬因子mRNA檢測，可同時檢測到音猬因子表達中等信號和低信號。損傷區(qū)內(nèi)音猬因子表達為中等信號，損傷區(qū)遠端10 mm處音猬因子表達為低信號。隨后在脊髓損傷模型制作后的第7天，音猬因子mRNA表達水平在損傷區(qū)遠端10 mm處的灰質(zhì)和白質(zhì)中表達達到最大值，可見高信號，通過染色后鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在少突膠質(zhì)細胞中音猬因子表達水平最高，室管膜區(qū)域內(nèi)音猬因子mRNA表達僅存在于損傷區(qū)域的5 mm范圍內(nèi)，分布區(qū)域較小。而在空白組的5只大鼠中，全時間段均未見到音猬因子mRNA表達。同時在免疫組化檢測中，僅少突膠質(zhì)細胞中存在音猬因子表達，而星形膠質(zhì)細胞中則未見音猬因子表達。

3 討 論

根據(jù)相關(guān)研究報道[4-5]，可以確定音猬因子是脊髓腹側(cè)神經(jīng)干細胞分化過程中的活躍成分，從某種意義上來說音猬因子決定了胚胎期神經(jīng)細胞的增殖和分化方向，是神經(jīng)系統(tǒng)再生的重要元素[6]。

在本組研究中，共準(zhǔn)備了30只成年健康大鼠為研究樣本，共制作了5只空白組和25只脊髓損傷模型組，同時從行為學(xué)評估、免疫組化和音猬因子mRNA檢測3個方面對空白組和脊髓損傷模型組進行評價。得到以下結(jié)論：①隨著時間的推移，音猬因子表達強度由低到高，與大鼠肢體功能恢復(fù)周期相吻合。②音猬因子表達的最高信號在損傷區(qū)域內(nèi)遠端10 mm和少突膠質(zhì)細胞中，星形膠質(zhì)細胞中未見音猬因子表達。③音猬因子表達并非脊髓損傷后立即出現(xiàn)，從出現(xiàn)到達到高信號有一定時間差。

因此綜上所述，音猬因子表達和脊髓神經(jīng)功能再生有密切聯(lián)系，極有可能與神經(jīng)再生有關(guān)，如果想要完全確認音猬因子和脊髓損傷后神經(jīng)功能再生的關(guān)聯(lián)性，需要進一步研究，但不可否認脊髓損傷是激活音猬因子表達的重要條件。