海洋經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物肌肉副肌球蛋白分布特性初探

宋 揚(yáng)，田元勇，張 晴，周晏琳，袁春紅，劉俊榮

(1.大連海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.巖手大學(xué) 農(nóng)學(xué)部，日本 巖手縣 0208550 )

經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)構(gòu)成我國(guó)最重要的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，2016年我國(guó)海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量約1.96×107t，其中經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)產(chǎn)量約為1.42×107t，占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的72%[1]。除傳統(tǒng)加工品外，活品貝類(lèi)因高品質(zhì)和高附加值越來(lái)越受到消費(fèi)者歡迎和產(chǎn)業(yè)重視。活品貝類(lèi)的品質(zhì)除受捕后流通條件影響以外，與肌肉蛋白組分及理化性質(zhì)有直接的關(guān)系，此外，不同經(jīng)濟(jì)品種之間的差異也不可忽視。與脊椎類(lèi)的魚(yú)體肌肉相比，副肌球蛋白為肌原纖維蛋白中主要組分之一，并以副肌球蛋白為核心，再結(jié)合肌球蛋白構(gòu)成粗絲，因此，貝類(lèi)的肌絲直徑相比于脊椎動(dòng)物更粗[2]。近些年，對(duì)副肌球蛋白結(jié)構(gòu)[3-8]、蛋白表達(dá)及氨基酸序列[9-11]、凝膠性及免疫活性等功能特性[12-15]的研究頗多。Yphantis等[16]發(fā)現(xiàn)，硬殼蛤(Mercenariamercenaria)副肌球蛋白在提取過(guò)程中容易發(fā)生降解，提取液中加入0.01 mol/L EDTA，可得到分子量為210 ku的α型副肌球蛋白，而前人采用醇沉法得到的200 ku β型副肌球蛋白，為α型的降解產(chǎn)物。Yeung等[5]進(jìn)一步證明，β副肌球蛋白是α副肌球蛋白C末端肽鏈部分降解產(chǎn)生。此外，在硬殼蛤肌肉中還發(fā)現(xiàn)了副肌球蛋白的聚合物[17]，副肌球蛋白的聚合物是否在所有軟體動(dòng)物中存在，其為天然形成的還是在提取過(guò)程中形成的尚不明確。

副肌球蛋白在貝類(lèi)肌肉緊張收縮機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18]，也會(huì)對(duì)貝類(lèi)死后肌肉的變化產(chǎn)生重大影響，進(jìn)而影響高端產(chǎn)品如刺身產(chǎn)品的品質(zhì)。探究副肌球蛋白性質(zhì)，便于進(jìn)一步揭示貝類(lèi)活品品質(zhì)及死后貝類(lèi)肌肉狀態(tài)變化機(jī)理。另外，相對(duì)于魚(yú)類(lèi)肌動(dòng)球蛋白凝膠機(jī)理，貝類(lèi)副肌球蛋白獨(dú)特的凝膠特性，在改善肌動(dòng)球蛋白凝膠方面同樣具有探索價(jià)值[13-14]?？傊斜匾獙?duì)貝類(lèi)肌肉中副肌球蛋白的分布及性質(zhì)進(jìn)行先期系統(tǒng)研究。

選取菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannaiino)、脈紅螺(Rapanavanosa)及長(zhǎng)蛸(Octopusvariabilis)等5個(gè)常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)品種作為研究對(duì)象，在各品種可食部分的一般組成及特性比較基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對(duì)肌肉組織副肌球蛋白的分布特性進(jìn)行初步鑒定，旨在逐步揭示蛋白組分特別是副肌球蛋白與貝類(lèi)肌肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)機(jī)制，包括不同品種肌肉品質(zhì)的差異，以及捕獲后活品品質(zhì)變化等機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所用化學(xué)試劑主要有SDS、聚丙烯酰胺及β-巰基乙醇(美國(guó)Sigma公司)。尿素、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、高氯酸等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),所用試劑均為分析純。

所用儀器設(shè)備有HG-200高速分散均質(zhì)機(jī)(日本HSIANGTAI公司)、GL-21M高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)、AE-6500平板電泳槽(日本ATTO株式會(huì)社)、Lambda 25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(珀金埃爾默儀器有限公司)、L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立高新技術(shù)公司)、MALDI TOF/TOF 4800飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(AB SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司)。

1.2 原料采集與樣品處理

菲律賓蛤仔、毛蚶、脈紅螺、皺紋盤(pán)鮑、長(zhǎng)蛸于2016年6月購(gòu)自大連新長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)，全部為活品狀態(tài)，運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行處理。其中，菲律賓蛤仔及毛蚶分別取全部軟體組織，閉殼肌(菲律賓蛤仔)及足肌(毛蚶)，脈紅螺與皺紋盤(pán)鮑取肌肉組織，長(zhǎng)蛸取外套膜和足部。上述各樣品采取后迅速于-40 ℃下保存待分析。

一般化學(xué)組成采用原料可食部位(菲律賓蛤仔、毛蚶全部軟體組織，皺紋盤(pán)鮑、脈紅螺除去內(nèi)臟后軟體組織，長(zhǎng)蛸肌肉組織)；氨基酸測(cè)定取各樣品肌肉組織(菲律賓蛤仔閉殼肌，毛蚶、皺紋盤(pán)鮑、脈紅螺足肌，長(zhǎng)蛸外套膜)。

1.3 分析方法

1.3.1 一般化學(xué)組成分析

一般化學(xué)組成分析包括水分、粗脂肪、粗蛋白、總糖及灰分。分別采用直接干燥法(GB 5009.3—2010)測(cè)定水分含量，灼燒稱(chēng)量質(zhì)量法(GB 5009.4—2010)測(cè)定粗灰分含量，凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)測(cè)定粗脂肪含量，采用分光光度法(GB 9695.31—2008)測(cè)定總糖含量。

1.3.2 氨基酸組成分析

采用酸水解法(GB/T 5009.124—2003)測(cè)定樣品中氨基酸含量。分別稱(chēng)取各種類(lèi)肌肉樣品0.1 g，加入6 mol/L HCl于蛋白水解管中，吹入氮?dú)饷芊夂笥?10 ℃烘箱中水解24 h，采用定量濾紙過(guò)濾后，蒸餾水定容至25 mL，取4 mL在真空條件下50 ℃水浴蒸發(fā)，用4 mL 0.02 mol/L HCl溶解，稀釋4倍后用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量，上樣量20 μL。

1.3.3 蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家委員會(huì)于1973年推薦的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式(干基)[19]，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，氨基酸評(píng)分(AAS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)按下式計(jì)算：

式中，n為比較的必需氨基酸個(gè)數(shù)，a、b、c、…、g為貝類(lèi)肌肉蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量(%)，ae、be、ce、…、ge為全雞蛋蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量(%)。

1.3.4 蛋白組成及定量分析

分別稱(chēng)取5種軟體動(dòng)物肌肉樣品5.0 g，加入4倍體積0.1 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)緩沖溶液，以30 s為間隔，于10 000 r/min條件下均質(zhì)3次，每次均質(zhì)時(shí)間為30 s，以上操作在冰水浴中進(jìn)行。分別取0.02 mL勻漿液，加入2.0 mL蛋白溶解液[含有2% SDS，8 mol/L尿素、2% β-巰基乙醇，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)]，混勻后于100 ℃加熱5 min。取0.01 mL用于SDS-PAGE分析。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%，考馬斯R-250染色，醋酸甲醇溶液進(jìn)行脫色。使用Multimate Gauge軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行定量分析。

1.3.5 質(zhì)譜分析

將SDS-PAGE干膠粒用0.4 mL 0.1 mol/L NH4HCO3/30% ACN脫色液清洗脫色至透明，棄上清液，加入 0.1 mol/L NH4HCO3，室溫孵育15 min。棄上清液凍干，之后加入測(cè)序級(jí)Trypsin溶液，37 ℃酶解。吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，原管加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA,超聲15 min。合并酶解液并凍干，凍干樣品用2 μL 20%乙腈復(fù)溶。取1 μL溶解樣品，直接點(diǎn)于樣品靶上，溶劑自然干燥后，再取0.5 μL過(guò)飽和CHCA基質(zhì)溶液，點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥。并用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)試分析，激光源為355 nm波長(zhǎng)的Nd：YAG激光器，加速電壓為2 kV，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為0～4000 Da，選擇信噪比>50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分析。數(shù)據(jù)使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析處理，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)組成特性及氨基酸分布

2.1.1 可食部位的一般化學(xué)組成特性

菲律賓蛤仔、毛蚶、脈紅螺、皺紋盤(pán)鮑及長(zhǎng)蛸5個(gè)研究樣本的一般化學(xué)組成(干基)分析結(jié)果見(jiàn)表1?？傮w來(lái)看，均呈現(xiàn)高蛋白低脂肪的基本化學(xué)特性，鮮品原料的水分含量為76%～83%，粗蛋白含量為60%～82%，粗脂肪含量低于4%，灰分7%～10%；總糖含量為10%～30%，也呈現(xiàn)了軟體類(lèi)多糖含量豐富的特征。

2.1.2 肌肉組織的氨基酸分布特性

對(duì)5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉中氨基酸種類(lèi)和含量進(jìn)行分析(表2)。除色氨酸在酸水解處理過(guò)程中被破壞未能檢出，幾種原料肌肉中均含有17種氨基酸，并且亮氨酸和賴(lài)氨酸在幾種原料中的含量均較高，原料間無(wú)顯著差異。非必需氨基酸中，丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及谷氨酸含量較高，谷氨酸最多，含量為2.58～3.31 g/100 g。根據(jù)必需氨基酸評(píng)分，菲律賓蛤仔和毛蚶必需氨基酸指數(shù)分別為51.75、56.13。脈紅螺、皺紋盤(pán)鮑、長(zhǎng)蛸必需氨基酸指數(shù)分別為62.82、64.04、72.48。纈氨酸為菲律賓蛤仔、脈紅螺、長(zhǎng)蛸、皺紋盤(pán)鮑的第一限制性氨基酸，甲硫氨酸+半胱氨酸為毛蚶第一限制氨基酸。幾種原料必需氨基酸/總氨基酸接近世界衛(wèi)生組織/國(guó)際糧農(nóng)組織推薦的模式35.38%，是優(yōu)質(zhì)食用蛋白源(表3)。

表1 5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物可食部位的一般化學(xué)組成 %

注：大寫(xiě)字母代表不同原料間濕基差異顯著(P<0.05)，小寫(xiě)字母代表不同原料間干基差異顯著(P<0.05).其他表同.

表2 5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉蛋白的氨基酸組成比較 g/100 g濕基

注：**必需氨基酸.

表3 5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉蛋白必需氨基酸評(píng)分比較

2.2 肌肉組織的蛋白組成與分布

2.2.1 肌肉蛋白組分分析

對(duì)5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉組織進(jìn)行蛋白組成分析(圖1)。結(jié)果表明，其共性特征體現(xiàn)在，均含有肌動(dòng)蛋白(44.3 ku附近)、副肌球蛋白(97.2 ku附近)、肌球蛋白(200 ku附近)及肌球蛋白輕鏈等重要蛋白組分，此外，還含有水溶性蛋白條帶。不同品種間肌肉蛋白組成的差異體現(xiàn)在未知蛋白聚合物上(200 ku以上)，除頭足類(lèi)(長(zhǎng)蛸)外，其余4種均出現(xiàn)分子量高于肌球蛋白(200 ku)的蛋白聚合物條帶，從分子量估算，其極有可能是副肌球蛋白聚合體，后續(xù)對(duì)該條帶進(jìn)行了分析鑒定(見(jiàn)2.3)；此外，值得關(guān)注的是，副肌球蛋白分子量的大小表現(xiàn)出品種間的差異，有待進(jìn)一步探究。

2.2.2 肌肉蛋白組分的定量分析

進(jìn)一步對(duì)5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉的蛋白組成進(jìn)行定量分析(表4)。結(jié)果表明，肌球蛋白在毛蚶、長(zhǎng)蛸、皺紋盤(pán)鮑中占比均大于20%，菲律賓蛤仔和脈紅螺則為17%～18%；肌動(dòng)蛋白含量平均約30%，其中毛蚶足肌中占比最大為38.74%，菲律賓蛤仔占比最小，為21.63%；副肌球蛋白單體在皺紋盤(pán)鮑、脈紅螺、長(zhǎng)蛸中含量約為25%，在毛蚶和菲律賓蛤仔肌肉中占比分別為17.08%、19.88%；此外，菲律賓蛤仔、毛蚶及皺紋盤(pán)鮑還分布有分子量高于200 ku的蛋白聚合物(2.3部分鑒定為副肌球蛋白聚合體)，占比分別為7.47%、15.94%及15.31%?？傮w而言，副肌球蛋白在菲律賓蛤仔、毛蚶及皺紋盤(pán)鮑肌肉組織中含量比較豐富，依次為27.35%、33.02%和35.22%。

圖1 5種海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物肌肉蛋白的SDS-PAGE分析a.標(biāo)準(zhǔn)蛋白； b.菲律賓蛤仔； c.毛蚶； d.皺紋盤(pán)鮑； e.脈紅螺； f.長(zhǎng)蛸.

2.3 副肌球蛋白的質(zhì)譜分析與鑒定

菲律賓蛤仔、毛蚶、皺紋盤(pán)鮑以及脈紅螺均在肌球蛋白條帶上方出現(xiàn)未知蛋白條帶，依次為圖1中所示1、3、5、7；為進(jìn)一步分析鑒定疑似副肌球蛋白聚合物的未知條帶，結(jié)合副肌球蛋白條帶(圖1中2、4、6、8)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

以菲律賓蛤仔為例，未知蛋白聚合物(條帶1)和副肌球蛋白(條帶2)在蛋白總分可信度高于95%條件下，均能夠與同種副肌球蛋白匹配，覆蓋率分別為23%和19%(表5)，且從SDS-PAGE的移動(dòng)距離可計(jì)算副肌球蛋白(條帶2)分子量，為101.4 ku，未知蛋白聚合物(條帶1)蛋白分子量為211.0 ku，由此，推測(cè)該未知蛋白聚合物即是副肌球蛋白聚合體(aPM)。同樣，推定毛蚶(條帶3)與皺紋盤(pán)鮑(條帶5)為副肌球蛋白的聚合體。

表4 5種海洋經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物肌肉蛋白組成分析結(jié)果 %

注：*未知蛋白條帶經(jīng)質(zhì)譜分析為副肌球蛋白聚合體；**經(jīng)質(zhì)譜分析非副肌球蛋白聚合體.

表5 5種海洋經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物肌肉組織中副肌球蛋白的分析鑒定

注：*長(zhǎng)蛸，經(jīng)分析鑒定，不含副肌球蛋白聚合體條帶；**脈紅螺，經(jīng)分析鑒定，聚合體條帶未鑒定為副肌球蛋白.

3 討 論

相對(duì)于脊椎魚(yú)類(lèi)，副肌球蛋白在無(wú)脊椎動(dòng)物中的分布具有突出的特點(diǎn)，也曾受到不同領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。副肌球蛋白的研究始于20世紀(jì)初，起初研究主要以雙殼貝類(lèi)閉殼肌為研究對(duì)象，20世紀(jì)40年代中期獲得命名“副肌球蛋白”[20]，20世紀(jì)70年代，一些小型環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)和線性動(dòng)物門(mén)的副肌球蛋白研究較為活躍[21-22]。在此之后20年間陸續(xù)有關(guān)于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的研究。Melson等[23]對(duì)幾種軟體動(dòng)物肌肉副肌球蛋白提取發(fā)現(xiàn)，含有0.01 mol/L EDTA與不含EDTA提取的硬殼蛤(Mercenariamercenaria)副肌球蛋白分子量相差7 ku，但是對(duì)美洲牡蠣(Crassostreavirginica)、左旋香螺(Busyconcontrarium)、西印度石鱉(Acanthopleuragranulata)無(wú)影響；Mykles[24]研究了美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)肌肉中蛋白組分，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈分子量為175 ku、肌動(dòng)蛋白分子量為41 ku、原肌球蛋白34 ku、副肌球蛋白分子量為96～99 ku；Costello等[25]研究表明，美洲螯龍蝦不同組織肌肉中副肌球蛋白分子量分別為105 ku和110 ku；Sonobe等[3]報(bào)道，副肌球蛋白廣泛存在于海參、海膽等后口動(dòng)物平滑肌中，但脊椎動(dòng)物中無(wú)論平滑肌還是橫紋肌均沒(méi)有副肌球蛋白，在無(wú)脊椎動(dòng)物向脊椎動(dòng)物過(guò)渡態(tài)的文昌魚(yú)肌肉中不含副肌球蛋白，但在文昌魚(yú)脊索中檢測(cè)到了副肌球蛋白，其在進(jìn)化過(guò)程中副肌球蛋白表達(dá)受到抑制，進(jìn)而在進(jìn)化過(guò)程中逐漸消失。到近些年才有關(guān)于副肌球蛋白功能性在原料學(xué)屬性方面的研究[14-15,26]?？傮w來(lái)講，有關(guān)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)類(lèi)的研究缺乏系統(tǒng)連續(xù)性。

5種海洋經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物蛋白分布呈現(xiàn)差異性，不同品種間蛋白組成差異可能影響肌肉蛋白的功能性。Fukuda等[14,27]研究表明，副肌球蛋白比肌動(dòng)球蛋白具有更好的凝膠強(qiáng)度。當(dāng)溫度大于55 ℃，副肌球蛋白凝膠比肌動(dòng)球蛋白具有更好的彈性，尤其在80 ℃，盡管蛋白含量很低，副肌球蛋白凝膠韌性遠(yuǎn)大于肌動(dòng)球蛋白。王帥[28]等報(bào)道，鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)肌肉添加扇貝閉殼肌后，能明顯地提高產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度。

菲律賓蛤仔、毛蚶、皺紋盤(pán)鮑肌肉中含有副肌球蛋白聚合體，關(guān)于副肌球蛋白聚合體的形成機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道，為探討是否為樣品處理過(guò)程導(dǎo)致單體發(fā)生聚合，將菲律賓蛤仔閉殼肌直接用蛋白變性劑處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果顯示，同樣存在副肌球蛋白聚合體的條帶，由此初步推測(cè)副肌球蛋白聚合體可能為天然存在。Watabe等[18,29]對(duì)硬殼蛤閉殼肌磷酸化研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白中只有副肌球蛋白聚合體能被內(nèi)源性激酶磷酸化。此外，還證明了磷酸化位點(diǎn)位于副肌球蛋白C末端。“Catch”肌肉中副肌球蛋白磷酸化水平高于非“Catch”肌肉。聚合體的形成是否與磷酸化機(jī)制有關(guān)值得進(jìn)一步探索。

經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物肌肉蛋白組分具有動(dòng)物源蛋白的共性，均含有肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、副肌球蛋白及原肌球蛋白等主要蛋白組分。副肌球蛋白對(duì)軟體類(lèi)肌肉蛋白功能性質(zhì)的影響值得關(guān)注，一方面，副肌球蛋白在軟體類(lèi)中含量十分顯著，另一方面，副肌球蛋白的分布特性具有品種的差異性。本研究為揭示蛋白組分特別是副肌球蛋白與貝類(lèi)肌肉品質(zhì)關(guān)聯(lián)機(jī)制的前期工作，進(jìn)一步的研究將在不同品種肌肉品質(zhì)的差異以及捕獲后活品品質(zhì)變化機(jī)理等方面開(kāi)展。