還原型谷胱甘肽對大菱鲆生長及抗氧化能力的影響

李曉美，鮑枳月，吳立新，畢錚錚，許亞琴，翟春雨，陳家俊

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，俗稱多寶魚，原產(chǎn)于大西洋東北沿岸，其生長速度快，適應(yīng)低水溫，容易接受配合飼料且轉(zhuǎn)化率高[1]，特別適合我國北方沿海的工廠化養(yǎng)殖[2]。隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變，在提高產(chǎn)量的同時工廠化養(yǎng)殖模式也給大菱鲆養(yǎng)殖帶來一定影響。高密度養(yǎng)殖造成惡化的水環(huán)境[3]，在加工、儲藏、運輸過程中保存不當(dāng)而氧化酸敗的飼料[4]，疾病，運輸?shù)裙芾矸矫嬖斐傻牟僮髅{迫[5]，均會對大菱鲆造成氧化應(yīng)激，對其生長發(fā)育造成損傷，甚至致其死亡。

研究表明，可通過營養(yǎng)調(diào)控來消除或緩解脅迫對水產(chǎn)動物造成的應(yīng)激，其中非營養(yǎng)型免疫增強劑(免疫多糖、抗氧化劑等)可促進其生長和抗脅迫能力[3]。谷胱甘肽(通常指還原型谷胱甘肽)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通過肽鍵形成的廣泛存在于細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的活性肽[6]。還原型谷胱甘肽為非蛋白質(zhì)低分子量的硫醇，屬于非酶性的抗氧化劑，其通過電子和質(zhì)子的傳遞作用實現(xiàn)清除氧自由基、解毒、維持DNA的生物合成及細(xì)胞免疫等多種功能[7]。其中最重要的功能就是維持機體氧化與抗氧化的動態(tài)平衡[8]。目前，水產(chǎn)飼料中應(yīng)用還原型谷胱甘肽的研究表明，飼料中添加適量的還原型谷胱甘肽能顯著提高吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)[9]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[10]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[11]、奧尼羅非魚(O.niloticus×O.aureus)[12]、褐牙鲆(Paralichthysoliveaceus)[13]的生長性能和抗氧化能力；而在草魚(Ctenopharyngodonidella)飼料中添加還原型谷胱甘肽，對其生長及餌料系數(shù)無顯著影響，但可以顯著提高肝臟中總抗氧化能力，降低肝臟及血清中活性氧水平[14]；飼料中添加還原型谷胱甘肽對皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannailna)的質(zhì)量增加率無顯著影響，但對抗氧化系統(tǒng)起到了改善作用[15]。

筆者選用大菱鲆為試驗對象，在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的還原型谷胱甘肽，研究其對大菱鲆生長發(fā)育和抗氧化能力的影響，確定還原型谷胱甘肽在大菱鲆飼料中的最適添加量，為還原型谷胱甘肽在大菱鲆飼料中的應(yīng)用及大菱鲆健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白源，以高筋小麥粉為主要糖源，以魚油、大豆磷脂為主要脂肪源配制等氮等能的基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加還原型谷胱甘肽0、100、200、400、600 mg/kg，配制5種試驗飼料。

各原料粉碎后過60目篩，按試驗配比逐級擴大混合均勻，用制粒機擠壓成粒徑為2 mm的顆粒飼料，自然風(fēng)干至水分約10%放入自封袋，置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成 %

注：①維生素混合物為每千克預(yù)混料提供:維生素A ，1 000 000 IU; 維生素D3，300 000 IU; 維生素E，4000 IU; 維生素K3，1000 mg; 維生素B1，2000 mg; 維生素B2，1500 mg; 維生素B6，1000 mg; 維生素B12，5 mg; 煙酸，1000 mg; 維生素C，5000 mg; 泛酸鈣，5000 mg; 葉酸，100 mg; 肌醇，10 000 mg; 載體葡萄糖及水≤10%. ②礦物質(zhì)混合物為每千克預(yù)混料提供：NaCl，107.79 mg; MgSO4·7H2O，380.02 mg; NaH(H2PO4)·2H2O，241.91 mg; KH2PO4，665.20 mg; CaHPO4·2H2O，376.70 mg; 檸檬酸鐵，82.38 mg; 乳酸鈣907.10 mg; Al(OH)3，520.00 mg; ZnSO4·7H2O，990 mg; CuSO4·5H2O，10.00 mg; MgSO4·7H2O，2220 mg; Ca(IO3)2，420 mg; CoCl2·6H2O, 77 mg. ③抗氧化劑為2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT). ④還原型谷胱甘肽，購于Solarbio公司，純度>98%。

1.2 飼養(yǎng)與管理

大菱鲆幼魚購于大連天正實業(yè)有限公司，投喂基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)兩周，待其適應(yīng)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境后選用無病害無外傷，初始質(zhì)量為(23.08±0.09) g的個體隨機分組進行試驗。

試驗使用15個60 cm×45 cm×40 cm水族箱(實際用水量90 L)，每個水族箱為1個養(yǎng)殖單位，共設(shè)5個處理，每個處理3個重復(fù)組，每個重復(fù)放養(yǎng)14尾魚，養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。試驗期間采用自然光照，日投喂2次(8:00和18:00)，投喂30 min后收集殘餌。換水1次/d，換水量為33.3%～50%，試驗水溫14～18.5 ℃，溶解氧>6 mg/L。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束前，將大菱鲆禁食24 h，每箱分別稱量質(zhì)量和計數(shù)。每個水族箱隨機取5尾魚，稱量其體質(zhì)量，采集肝臟，稱量質(zhì)量后液氮速凍置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。分別按下式計算質(zhì)量增加率及特定生長率：

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，m1為初始體質(zhì)量(g)，m2為終末體質(zhì)量(g)，t為養(yǎng)殖時間(d)。

1.4 樣品測定

取采集的肝臟組織加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水作為勻漿介質(zhì)(m/V=1/9)在冰水浴下機械勻漿混合均勻，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取上清液，進行指標(biāo)測定。

總蛋白測定使用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測試盒；總抗氧化能力的測定使用南京建成生物工程研究所總抗氧化能力測定測試盒，利用抗氧化物質(zhì)還原Fe2+與菲啉類物質(zhì)反應(yīng)比色測定；丙二醛的測定使用南京建成生物工程研究所丙二醛測試盒，利用丙二醛與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物比色進行測定；超氧化物歧化酶的測定使用南京建成生物工程研究所超氧化物歧化酶測試盒；還原型谷胱甘肽的測定使用南京建成生物工程研究所微量還原型谷胱甘肽測試盒，利用微量酶標(biāo)法測定；谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶的測定使用南京建成生物工程研究所谷胱甘肽過氧化物酶測試盒，利用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物的反應(yīng)比色測定；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶使用南京建成生物工程研究所谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶測試盒，利用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶催化還原型谷胱甘肽與1-氯2,4-二硝基苯底物結(jié)合比色測定。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。如差異顯著(P<0.05)時，用Duncan多重比較檢驗組間差異。

2 結(jié) 果

2.1 還原型谷胱甘肽對大菱鲆生長的影響

飼料中添加還原型谷胱甘肽能不同程度提高大菱鲆的質(zhì)量增加率和特定生長率，隨著還原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆質(zhì)量增加率和特定生長率均呈先升后降的趨勢(表2)。其中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg的試驗組，大菱鲆的質(zhì)量增加率和特定生長率均顯著高于其他組(P<0.05)，其他各組間差異不顯著(P>0.05)。通過線性回歸分析建立預(yù)測模型，經(jīng)回歸方程計算得出，當(dāng)飼料中還原型谷胱甘肽添加量為189.70 mg/kg時，大菱鲆特定生長率達(dá)到最高值1.67%(圖1)。

表2 還原型谷胱甘肽對大菱鲆生長的影響(n=3)

注：表中同一列內(nèi)右上角標(biāo)有不同英文字母的數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05).

圖1 還原型谷胱甘肽對大菱鲆特定生長率的影響

2.2 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟丙二醛含量、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力的影響

飼料中添加還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中丙二醛含量、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力均無顯著影響(P>0.05)(圖2～圖4)，隨著還原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆肝臟中丙二醛含量呈先降后升的趨勢，其中對照組丙二醛含量最高，還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg試驗組最低。隨著還原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆肝臟中總抗氧化能力、 超氧化物歧化酶活力呈先升后降的趨勢，其中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg試驗組最高，分別為(1.99±0.12)、(99.32±3.09) U/mg。

2.3 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中還原型谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響

隨著飼料中添加的還原型谷胱甘肽含量的增加，大菱鲆肝臟中還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過氧化物酶活力均呈先升后降的趨勢(圖5、圖6)。當(dāng)飼料中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg時，大菱鲆肝臟中還原型谷胱甘肽含量最高，其中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg和400 mg/kg的試驗組，大菱鲆肝臟中還原型谷胱甘肽含量顯著高于對照組(P<0.05)。當(dāng)飼料中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg時，大菱鲆肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶活力最高，但試驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活力、谷胱甘肽還原酶活力的影響

隨著飼料中添加的還原型谷胱甘肽含量的增加，大菱鲆肝臟中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽還原酶活力均呈先降后升的趨勢(圖7、圖8)。當(dāng)飼料中還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg時，大菱鲆肝臟中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶及谷胱甘肽還原酶活力均最低，分別為(38.08±5.68) U/mg、(6.87±0.87) U/g，顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中丙二醛含量的影響

圖3 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中總抗氧化能力的影響

圖4 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中超氧化歧化酶活力的影響

圖5 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中還原型谷胱甘肽含量的影響

圖6 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響

圖7 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活力的影響圖中標(biāo)有不同英文字母的數(shù)據(jù)之間有顯著差異(P<0.05).下同.

圖8 還原型谷胱甘肽對大菱鲆肝臟中谷胱甘肽還原酶活力的影響

3 討 論

3.1 飼料中添加還原型谷胱甘肽對大菱鲆生長的影響

研究表明，飼料中添加還原型谷胱甘肽會對水產(chǎn)動物生長性能產(chǎn)生積極的影響，可促進水產(chǎn)動物的生長[16]，且作用機制為多方面系統(tǒng)協(xié)調(diào)的結(jié)果。劉曉華等[11]的研究表明，在飼料中添加一定含量的還原型谷胱甘肽能夠提高凡納濱對蝦的質(zhì)量增加率和飼料效率，并指出還原型谷胱甘肽可通過中間代謝產(chǎn)物半胱胺破壞生長抑制分子的二硫鍵，解除生長抑制素對生長激素的控制，促使生長激素在現(xiàn)有水平上有所提高，從而促進機體生長。趙紅霞等[17]研究表明，飼料中添加還原型谷胱甘肽能夠通過調(diào)節(jié)草魚生長激素水平，提高類胰島素一號增長因子水平，從而達(dá)到促進草魚生長的作用。周婷婷等[9]研究表明，飼料中添加還原型谷胱甘肽能促進蛋白質(zhì)的合成，提高吉富羅非魚的攝食量。并且這些結(jié)論在虹鱒[10]、褐牙鲆[13]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[18]和奧尼羅非魚[19]等試驗中均已得到證實。

本試驗在基礎(chǔ)飼料配方基礎(chǔ)上添加不同劑量的還原型谷胱甘肽，結(jié)果顯示，在大菱鲆飼料中添加還原型谷胱甘肽能顯著提高大菱鲆的生長性能，飼料中添加還原型谷胱甘肽的試驗組大菱鲆的質(zhì)量增加率和特定生長率明顯高于未添加還原型谷胱甘肽的對照組，并在添加量為200 mg/kg時達(dá)到顯著水平，與上述試驗結(jié)果一致。另外，有研究指出，動物腸腔中的還原型谷胱甘肽能將過氧化物清除，從而保護腸黏膜[20]；Venurini[21]的研究提到，還原型谷胱甘肽能提高水螅(Hydraattenuate)的攝食反應(yīng)。由此可見，還原型谷胱甘肽對大菱鲆生長性能的促進作用是一系列機制作用的結(jié)果，具體的生長作用機制還有待進一步研究。

3.2 飼料中添加還原型谷胱甘肽對大菱鲆抗氧化能力的影響

實際生產(chǎn)中，存在很多對生物體造成氧化應(yīng)激的因素，使機體產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生超過其分解速率而對其機體甚至生長發(fā)育造成損傷。脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致二次產(chǎn)物的生成，如丙二醛是衡量不同海洋生物活性氧引起氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)[22]。在本試驗中，隨著飼料中還原型谷胱甘肽添加量的增加，丙二醛呈先降后升的趨勢，其中還原型谷胱甘肽添加組丙二醛的含量均低于對照組，還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg試驗組達(dá)到最低，但未達(dá)到顯著水平。表明還原型谷胱甘肽的外源添加一定程度上減輕了細(xì)胞的氧化損傷。

生物體為了在氧化與還原反應(yīng)中維持平衡，有一整套的抗氧化系統(tǒng)?？寡趸到y(tǒng)不斷作用清除自由基，調(diào)節(jié)機體內(nèi)活性氧水平，同時參與各種生化反應(yīng)，有效調(diào)控生物體氧化應(yīng)激，從而保證機體細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定和正常的生理機能。試驗結(jié)果中，隨著飼料中還原型谷胱甘肽添加量的增加，試驗組中大菱鲆肝臟中丙二醛含量均低于對照組，且結(jié)果中總抗氧化能力與超氧化物歧化酶活力的升高也證明了飼料中適量添加還原型谷胱甘肽能一定程度提高大菱鲆抗氧化能力。

本試驗飼料中添加還原型谷胱甘肽后，谷胱甘肽過氧化物酶活力的變化呈現(xiàn)與還原型谷胱甘肽、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力相同的變化趨勢，但未達(dá)到顯著水平?？赡苡捎谕庠葱赃€原型谷胱甘肽的添加，使得兩分子還原型谷胱甘肽巰基氧化脫氫轉(zhuǎn)變成一分子氧化型谷胱甘肽，清除了大部分氧自由基，本試驗中谷胱甘肽還原酶活性的降低也證明了體內(nèi)還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的動態(tài)平衡，可以依靠外源性還原型谷胱甘肽的添加來調(diào)節(jié)，而不需要完全由自身內(nèi)源性氧化型谷胱甘肽在谷胱甘肽還原酶的催化下轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽，來提升體內(nèi)還原型谷胱甘肽含量。這一結(jié)果與褐牙鲆[13]的試驗結(jié)果相似，但與虹鱒[10]、吉富羅非魚[23]的研究結(jié)果不同，所以谷胱甘肽還原酶在大菱鲆體內(nèi)的作用機制仍需進一步研究。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶大量存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶會快速釋放到血液中，因此谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶也可作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)[24]。在本試驗中，隨著飼料中還原型谷胱甘肽添加量的增加，丙二醛呈先降后升的趨勢，其中對照組最高，還原型谷胱甘肽添加量為200 mg/kg的試驗組達(dá)到最低，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶呈現(xiàn)與丙二醛相反的趨勢。進一步證明了適量添加還原型谷胱甘肽，能降低細(xì)胞中的氧化損傷。此外當(dāng)大菱鲆谷胱甘肽過氧化物酶呈下降趨勢時，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶呈對應(yīng)的上升趨勢。這一結(jié)果與褐牙鲆[13]、虹鱒[25]的研究結(jié)果類似。表明當(dāng)體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶活力低時，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶也可作為抗氧化的保護機制。

3.3 大菱鲆飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量

有研究表明，還原型谷胱甘肽雖然作為機體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，在生物中的濃度達(dá)到1 mmol/L時，也可具有促氧化劑作用，造成DNA損傷[26]。另外還原型谷胱甘肽作為氧化物的前體，過多積累也會產(chǎn)生毒性[27]，通過與還原型谷胱甘肽結(jié)合，可將一些化合物轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性、基因毒性或可導(dǎo)致誘變的代謝物[28]。

本試驗表明，飼料中添加還原型谷胱甘肽能一定程度提高還原型谷胱甘肽在肝臟中的積累，并與對照組呈顯著差異，這一結(jié)果與王芳倩等[13]結(jié)果一致。但何芬等[29-30]的研究顯示，飼料中添加還原型谷胱甘肽對肝臟中還原型谷胱甘肽的含量無顯著影響，這可能和試驗對象種類不同有關(guān)，具體機制有待進一步研究。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，大菱鲆的生長性能和抗氧化能力隨還原型谷胱甘肽含量的增加均呈先升后降的趨勢；肝臟中丙二醛的含量在添加量高于200 mg/kg后呈上升趨勢，表明在還原型谷胱甘肽添加量超過一定程度后，機體抗氧化能力下降，出現(xiàn)了一定程度的氧化損傷。這一結(jié)果與凡納濱對蝦[11]、褐牙鲆[13]、黃顙魚[18]的研究結(jié)果類似。說明只有在還原型谷胱甘肽添加量在合適的范圍內(nèi)，才具有促生長和促抗氧化能力的效果；如果添加過量會導(dǎo)致還原型谷胱甘肽在大菱鲆體內(nèi)過量積累，導(dǎo)致氧化損傷，可對魚體產(chǎn)生毒性作用。水產(chǎn)飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量因?qū)ο蠓N類的不同而有差異，虹鱒飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為200 mg/kg[10]；凡納濱對蝦飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為174.13 mg/kg[11]；褐牙鲆飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為368.92 mg/kg[13]；黃顙魚飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為357.69 mg/kg[18]；吉富羅非魚幼魚飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為355.13 mg/kg[23]；本試驗以特定生長率為評價指標(biāo)，通過線性回歸分析建立預(yù)測模型，經(jīng)回歸方程計算確定大菱鲆飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為189.70 mg/kg。

4 結(jié) 論

大菱鲆飼料中添加適量的還原型谷胱甘肽能促進大菱鲆的生長，提高大菱鲆抗氧化應(yīng)激能力，清除其體內(nèi)氧自由基，緩解養(yǎng)殖過程中對大菱鲆造成的氧化損傷，飼料中還原型谷胱甘肽最適添加量為189.70 mg/kg。