異常色譜峰來源排查——色譜儀研發(fā)測(cè)試過程中的經(jīng)驗(yàn)分享

高華云,耿浩然,王豐琳,唐 濤,李 彤*

(1. 大連工業(yè)大學(xué), 遼寧 大連 116034; 2. 大連依利特分析儀器有限公司, 遼寧 大連 116023)

高效液相色譜是分析化學(xué)領(lǐng)域中最常用的分析工具之一,強(qiáng)大的分離能力使其在化工醫(yī)藥、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生命科學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。但是,相對(duì)較弱的定性能力,增加了對(duì)儀器研發(fā)及測(cè)試過程中異?，F(xiàn)象的分析難度。

大連依利特分析儀器有限公司自2013年開始研發(fā)全新一代的iChrom 5100系列高效液相色譜系統(tǒng),并于2015年開始投放市場(chǎng)。無論是在樣機(jī)的研發(fā)測(cè)試還是在實(shí)際應(yīng)用過程中,出現(xiàn)過多次色譜峰異常的現(xiàn)象,即經(jīng)常出現(xiàn)一些可重復(fù)的“怪峰”(或稱之為“鬼峰”)。如圖1所示,按照流路順序方向排查流動(dòng)相、樣品、儀器硬件的問題,找到了部分異常峰的來源,但仍有個(gè)別異常峰沒能找到產(chǎn)生原因。如前述,色譜儀自身的定性能力不足,即便是配合使用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)獲取異常峰的紫外-可見光譜圖,仍然難以確定其具體組成及來源。分析并消除重復(fù)出現(xiàn)的異常峰,是儀器研發(fā)及應(yīng)用過程中必須解決的問題。

針對(duì)上述問題,我們經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn),對(duì)不同型號(hào)、規(guī)格的儀器進(jìn)行對(duì)比,通過科學(xué)分析找到了異常峰的一種有代表性的來源,在此分享給分析工作者。

1 異常色譜峰的發(fā)現(xiàn)

1.1 多肽類樣品的分析

圖2是某種需要進(jìn)行大規(guī)模制備的多肽樣品譜圖,可以看出,異常峰出現(xiàn)在全部樣品色譜峰之后(35 min左右)。理論上樣品峰之后的異常峰不影響實(shí)際樣品的分離以及制備實(shí)驗(yàn)的要求,但是為了藥物研究,有必要知道異常峰的來源以及組成。按照流路順序方向排查,經(jīng)過多次不同的實(shí)驗(yàn)證實(shí),圖中所示異常并不是樣品沒有完全流出或前一次實(shí)驗(yàn)遺留在色譜柱中的殘留多肽樣品。

1.2 氯代多環(huán)芳烴類樣品的分析

圖3是氯代多環(huán)芳烴類樣品及以流動(dòng)相作為空白樣品的譜圖,可以看出存在一組可重復(fù)的異常色譜峰(13.5～40.0 min)。氯代多環(huán)芳烴是多環(huán)芳烴氯化得到的產(chǎn)物,原料和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單且穩(wěn)定,理論上不會(huì)出現(xiàn)其他雜質(zhì)。通過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),目標(biāo)物氯代多環(huán)芳烴峰的保留時(shí)間為15.5 min,因此在13.5～18.0 min出現(xiàn)的異常峰會(huì)影響目標(biāo)檢測(cè)物氯代多環(huán)芳烴峰的定量分析。按照流路順序方向排查,經(jīng)多次不同條件測(cè)試證實(shí),所出現(xiàn)的異常峰現(xiàn)象與樣品進(jìn)樣與否、色譜柱溫度、儀器硬件等色譜實(shí)驗(yàn)條件無關(guān)。

圖 5 氯代多環(huán)芳烴類樣品的譜圖分析條件同圖3.

2 異常色譜峰的解析與驗(yàn)證

為解析異常色譜峰的來源,針對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按照流路順序方向?qū)α鲃?dòng)相、樣品、儀器硬件均進(jìn)行了替換試驗(yàn),同時(shí)還考察了不同填料、不同尺寸色譜柱、乙腈-水流動(dòng)相組成比例、溫度和儲(chǔ)存時(shí)間等,均沒有準(zhǔn)確找出異常峰的來源。之后對(duì)系統(tǒng)流路之外的前處理過程進(jìn)行考察,更換了不同材質(zhì)的樣品過濾膜和流動(dòng)相溶劑過濾膜,最終發(fā)現(xiàn)了異常峰的來源——溶劑過濾膜。

在實(shí)驗(yàn)過程中,過濾乙腈所使用的濾膜均為有機(jī)濾膜,包括尼龍66、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯3種。但濾膜的化學(xué)相容性表顯示,3種濾膜對(duì)乙腈的耐受程度不同,其中尼龍66的耐受能力最差。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,不同材質(zhì)的濾膜過濾乙腈后所產(chǎn)生的異常色譜峰存在著顯著的差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖4。材質(zhì)為尼龍66的濾膜所產(chǎn)生的異常峰響應(yīng)最大,約為2.5 V; 聚偏氟乙烯濾膜產(chǎn)生的峰高略低; 相對(duì)而言,聚四氟乙烯濾膜的測(cè)試結(jié)果是3種材質(zhì)中最好的,但是異常峰最少的是不經(jīng)過濾的乙腈。

在找到異常峰的來源后,對(duì)氯代多環(huán)芳烴類樣品進(jìn)行了重新分析,結(jié)果如圖5所示,異常峰不再出現(xiàn)。

圖 4 不同濾膜過濾乙腈后基線空白圖(a. 原始圖; b. 局部放大圖)色譜條件同多肽類樣品分析(圖2). 1. 不過膜; 2. 聚四氟乙烯膜; 3. 聚偏氟乙烯膜; 4. 尼龍66.

3 結(jié)語

從本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,濾膜是文中所述實(shí)驗(yàn)異常色譜峰產(chǎn)生的主要因素,由于不同材質(zhì)的濾膜對(duì)有機(jī)相的耐受能力不同,所產(chǎn)生的異常峰峰高之間也存在著顯著的差異。所以,建議在做色譜實(shí)驗(yàn)時(shí),若出現(xiàn)異常色譜峰時(shí),不僅要考慮流路系統(tǒng)上涉及的流動(dòng)相、樣品及儀器硬件可能帶來的影響,也同樣不能忽略像溶劑過濾膜這類前處理耗材帶來的影響。