固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定雞糞中四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素

余佩瑤,陳傳勝,劉寒冰,鄧艷玲,薛南冬*

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 湖南 長沙 410004;2. 中國環(huán)境科學(xué)研究院土壤與固體廢物環(huán)境研究所, 北京 100012)

抗生素被廣泛用于畜禽疾病防治[1],而畜禽攝入的抗生素中約30%～90%不能被吸收,以原藥或代謝產(chǎn)物形式隨糞便排出體外[2-4]。抗生素隨著糞便農(nóng)用在土壤中累積,通過地表徑流和淋濾等作用影響地表水和地下水環(huán)境,造成土壤和水環(huán)境中抗生素污染,對動(dòng)植物和微生物產(chǎn)生生態(tài)毒理效應(yīng),甚至威脅人類健康[5]。已有調(diào)查顯示,畜禽糞便中存在多種抗生素,四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素含量最多[6]。中國廣東地區(qū)豬糞樣品中喹諾酮類抗生素含量在0.02～1.52 mg/kg之間,磺胺類抗生素總含量在1.90～13.40 mg/kg之間[7];北京地區(qū)采集的雞糞樣品中，四環(huán)素類(土霉素、金霉素和四環(huán)素)含量最高可達(dá)23.43、19.03和14.56 mg/kg[8];華東地區(qū)采集的雞糞樣品中，四環(huán)素類和磺胺類抗生素含量最高分別達(dá)到354.0和7.10 mg/kg[9]。

畜禽糞便中不同種類抗生素的同時(shí)分析檢測對抗生素污染評估和治理具有重要意義[10]。目前,抗生素檢測方法大多針對污水[11-13]、液體食品[14,15]及養(yǎng)殖廢水[16]等液體基質(zhì),對畜禽糞便中抗生素的檢測方法大多研究某一類抗生素[17,18],對不同種類抗生素同時(shí)分析檢測的方法也大多按抗生素種類建立,需要分類提取檢測[19,20],主要采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13,21]及高效液相色譜法。前者靈敏度高,但是對復(fù)雜的糞便樣品存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),操作復(fù)雜且使用及維護(hù)成本高。高效液相色譜能使目標(biāo)物質(zhì)較好分離,且降低了分析成本。因此,建立畜禽糞便中多種類抗生素同時(shí)檢測的高效、快速和低成本方法尤為重要。

本研究對固相萃取和高效液相色譜檢測步驟中的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,建立了高效、低成本的固相萃取-高效液相色譜法,對畜禽糞便中常見的6種抗生素進(jìn)行同時(shí)提取檢測。6種抗生素包括常見的四環(huán)素類(土霉素,oxytetracycline, OTC;四環(huán)素,tetracycline, TCT)、喹諾酮類(諾氟沙星,norfloxacin, NOR;恩諾沙星,enrofloxacin, ENR)和磺胺類抗生素(磺胺二甲嘧啶,sulfamethazine, SMZ;磺胺甲惡唑, sulfamethoxazole, SMX)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); Waters Xterra RP18色譜柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm)(美國Waters公司); Oasis HLB柱(3 mL/60 mg)(美國Waters公司); Visiprep TM-DL固相萃取裝置(美國Supelco公司); HITACHICR21GⅡ高速離心機(jī)(日本HITACHI公司); DELTA320 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司); CM-12水浴氮吹儀(北京成蔭偉業(yè)科技有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX純度均≥99%(百靈威公司)。甲醇(methanol, MeOH)、乙腈(acetonitrile, ACN)、丙酮(acetone, ACE)和二氯甲烷(dichloromethane, DCM)均為色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。分析純磷酸、檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、EDTA-Na、乙酸(acetic acid)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用空白雞糞收集于河南某小型養(yǎng)雞場,調(diào)查顯示養(yǎng)雞場未施用過抗生素,實(shí)驗(yàn)室分析結(jié)果也表明該雞糞樣品不含OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX等目標(biāo)抗生素。實(shí)際樣品收集自遼寧省撫順市某小型養(yǎng)雞場。雞糞冷凍干燥,研磨,過1 mm篩待用。

準(zhǔn)確稱取6種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各100.00 mg,用甲醇溶解于100 mL棕色容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1 g/L的抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃冷藏保存。取配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.1 mL,用10 mL棕色容量瓶配制100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液,并稀釋成50.0、10.0、5.0、1.0、0.5 mg/L的抗生素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取過篩的雞糞樣品0.50 g,置于50 mL離心管中,加入提取劑EDTA-McIlvaine和有機(jī)混合提取液(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)各2.5 mL,渦旋混勻30 s, 30 ℃下超聲15 min,在8 000 r/min下離心15 min,取上層清液于50 mL離心管中,重復(fù)以上步驟3次,合并3次提取液,將液體在40 ℃水浴條件下濃縮至5 mL,用超純水定容到10 mL,以降低有機(jī)溶劑濃度[21]。過0.45 μm有機(jī)濾膜,準(zhǔn)備過HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。

HLB固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇和5 mL超純水活化,保持柱床濕潤,將濃縮液以1 mL/min的流速過柱,用5 mL 5%(v/v)甲醇水溶液淋洗小柱并真空抽干5 min,最后用5 mL甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)溶液洗脫,收集洗脫液,在40 ℃水浴條件下氮吹至近干,用乙腈-0.7%磷酸(1/9, v/v)定容至1 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜待測。

1.3 色譜條件

Waters Xterra RP18色譜柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm);柱溫32 ℃;二級(jí)陣列管檢測波長為270 nm;進(jìn)樣體積為10 μL;流速為0.8 mL/min;二元梯度洗脫,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.7%(v/v)磷酸溶液。洗脫程序?yàn)?0～20 min, 10%B; 20～35 min, 10%B～18%B; 35～40 min, 18%B～10%B; 40～50 min, 10%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法

2.1.1提取劑的選擇

抗生素提取劑很多。甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑因極性相似，可得到較大分配系數(shù)，被廣泛應(yīng)用于液體中喹諾酮類和磺胺類抗生素的提取[20]。EDTA-McIlvaine緩沖液是常見的雞糞中四環(huán)素類抗生素提取劑[22],可與四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生競爭,有效減少雞糞中金屬離子與四環(huán)素類抗生素中N、O官能團(tuán)的螯合[23]。針對抗生素的不同性質(zhì)采用不同提取劑,是提高提取效率的關(guān)鍵。為了選擇一種對6種抗生素的同時(shí)提取效果最佳的提取劑,本文選擇了不同提取劑M1(EDTA-McIlvaine)[22]、M2(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)[22,24]、M3(乙腈-乙酸,125∶1, v/v)[19]、M4(M1-M3, 1∶1, v/v)和M5(M1-M2, 1∶1, v/v)。加標(biāo)水平為10 μg/g,平行3次,比較不同提取劑單獨(dú)及等比例混合使用時(shí)各抗生素的回收率(見圖1)?？梢钥闯?單純以EDTA-McIlvaine緩沖液(M1)或者有機(jī)溶劑(M2、M3)作為提取劑時(shí),各類抗生素的提取效率都較低,回收率為21.0%～107.5%、20.7%～69.6%和22.1%～87.8%,說明單獨(dú)的無機(jī)溶劑或者有機(jī)溶劑只能提取雞糞中的小部分抗生素。在M1中加入等體積的酸化乙腈(M4)和有機(jī)混合溶液(M5)后,各抗生素的回收率得到改善。比較M4和M5發(fā)現(xiàn),M4雖然整體效果強(qiáng)于M1、M2和M3,但是對于磺胺類抗生素(SMZ、SMX)的提取效果較低,說明加入酸化乙腈只能輕微改變提取劑對磺胺類抗生素的提取效果。而加入有機(jī)混合溶液后,M5對各抗生素的提取效果均強(qiáng)于M4,回收率達(dá)到70.0%～116.3%之間。這說明單純以EDTA-McIlvaine緩沖液和一種有機(jī)溶劑混合并不能同時(shí)對多種抗生素達(dá)到較好的提取效果,提取劑中多種成分更有利于將雞糞中不同形態(tài)的抗生素提取出來[25]。所以選擇M5為提取劑。

圖 1 不同提取劑下6種抗生素的回收率(n=3)Fig. 1 Recoveries of the six antibiotics withdifferent extractants (n=3)

圖 2 不同pH值下6種抗生素的回收率Fig. 2 Recoveries of the six antibiotics with different pH

2.1.2pH值對固相萃取效果的影響

在固相萃取過程中,目標(biāo)物離子化程度影響吸附劑的吸附效率,而目標(biāo)物離子化程度則與pH值有關(guān)。本研究用HCl和NaOH調(diào)節(jié)M5提取液的pH值,比較酸性及中性條件下不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0)對6種抗生素添加回收率的影響(見圖2)。加標(biāo)水平為10 μg/g,不同pH的提取劑提取加標(biāo)樣品后,過HLB固相萃取柱凈化,以5 mL甲醇洗脫,平行3次。如圖2所示,pH為1～4時(shí),抗生素回收率相差不大;僅pH=3時(shí),目標(biāo)物回收率略有升高;當(dāng)提取劑pH為5時(shí),6種抗生素回收率達(dá)到最高;pH為5～7時(shí),抗生素的回收率隨pH的增大呈下降趨勢。樣品溶液的pH值影響樣品中分析物的化學(xué)形式、穩(wěn)定性以及分析物與固相萃取柱填料之間的相互作用。研究[26]發(fā)現(xiàn),不帶電荷的分析物與HLB固相萃取柱填料之間的作用力更強(qiáng)?；前奉惪股?pKa1=1.11～2.75, pKa2=4.18～7.59)[27]有芳香第一胺和磺酰胺基,是具有弱堿性和酸性的兩性電解質(zhì)，在pH=2～5時(shí)為中性。喹諾酮類抗生素結(jié)構(gòu)中含哌嗪基,有2個(gè)pKa值(pKa1=5.5～6.3, pKa2=7.6～8.5)[28],四環(huán)素類抗生素同樣有2個(gè)pKa值(pKa1=3.02～3.30, pKa2=7.40～7.97)[29]。喹諾酮類抗生素和四環(huán)素類抗生素在強(qiáng)酸性條件(pH=1～3)下以陽離子形式為主,回收率較低。在弱酸性條件下(pH=5), 6種目標(biāo)抗生素均以中性分子為主[30],更有利于達(dá)到最佳回收效果。

2.2 固相萃取

2.2.1淋洗液的優(yōu)化

雞糞組成復(fù)雜,經(jīng)提取劑提取后,提取液中含有較多雜質(zhì)。因此,需要選擇合適的淋洗液,洗掉附在柱上的雜質(zhì)又不影響目標(biāo)抗生素的回收。抗生素固相萃取中常用甲醇水溶液作為淋洗液,為了選出合適的淋洗液,比較了不同比例的甲醇水溶液淋洗下抗生素的加標(biāo)回收率。將抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到0.50 g雞糞樣品中,加標(biāo)水平為10 μg/g,提取步驟同2.1節(jié),濃縮過膜后的提取液通過HLB固相萃取柱,分別用5 mL不同體積分?jǐn)?shù)(0%、5%、15%、25%)的甲醇水溶液淋洗,抽干5 min后用5 mL甲醇洗脫。如表1所示,15%和25%甲醇水淋洗時(shí),有部分抗生素被洗脫,回收率低于60%;隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的降低,抗生素回收率逐漸升高;用純水和5%甲醇水溶液淋洗時(shí),各抗生素回收率相差不大。但是純水淋洗后,經(jīng)HLPC檢測雜質(zhì)峰過多,影響目標(biāo)物的響應(yīng)值,因此選擇用5%甲醇水溶液淋洗。

表 1 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液淋洗后6種抗生素的

圖 3 不同洗脫劑對雞糞中6種抗生素的洗脫效果(n=3)Fig. 3 Effect of different eluents on the elution efficiencies of the six antibiotics in chicken manure (n=3)

2.2.2洗脫劑的優(yōu)化

使用HLB固相萃取柱萃取,柱內(nèi)吸附填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,具有親水性和疏水性基團(tuán),通過親水或疏水相互作用力,可以保留多種極性差異較大的化合物,常用于抗生素固相萃取[31]。為了從HLB固相萃取柱上洗脫被吸附的化合物,本文比較了E1(甲醇-乙腈,7∶3, v/v)、E2(甲醇)和E3(甲醇-二氯甲烷,5∶5, v/v)3種有機(jī)溶劑的洗脫效果,平行3次。在0.50 g雞糞樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10 μg/g),提取步驟同2.1節(jié),洗脫劑均為5 mL。結(jié)果表明,甲醇中加入等體積二氯甲烷可以提高6種抗生素的洗脫效果,回收率高于純甲醇的0.3%～21.3%(OTC除外)(見圖3)。在甲醇中加入不同體積的二氯甲烷,發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇和二氯甲烷以體積比為7∶3時(shí),各抗生素洗脫效果達(dá)到最好,尤其提高了NOR和TCT的回收率,6種抗生素回收率達(dá)到70.0%～116.3%(見表2),高于純甲醇的3.3%～21.6%。因此選擇甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)作為固相萃取的洗脫溶劑。

表 2 不同體積比的甲醇-二氯甲烷對6種抗生素回收率的影響

2.3 色譜條件

2.3.1流動(dòng)相的選擇

高效液相色譜測定多種抗生素時(shí),調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值可以抑制弱堿的解離,進(jìn)而改變組分的保留時(shí)間,改善其分離度。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值常用甲酸、乙酸、磷酸和草酸[11,26],本研究分別用0.1%(v/v)的甲酸水溶液與乙腈(MP1)、0.7%(v/v)磷酸水溶液與乙腈(MP2)作為流動(dòng)相,同時(shí)測定6種抗生素。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用MP1作為流動(dòng)相等濃度洗脫,OTC和TCT重合;而采用梯度洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn),SMX拖尾嚴(yán)重,6種抗生素分離效果不好。選用MP2作為流動(dòng)相梯度洗脫,可以獲得良好的分離效果和適宜的保留時(shí)間,峰形尖銳,對稱性較好,無拖尾現(xiàn)象,6種抗生素在30 min內(nèi)可以獲得較好的分離。

2.3.2柱溫的選擇

色譜柱溫度會(huì)影響目標(biāo)分析物的出峰時(shí)間及分離效果。溫度升高可以使流動(dòng)相擴(kuò)散能力增強(qiáng),加快了流動(dòng)相的層流和分析物分子的混合,能有效調(diào)節(jié)柱效。本文研究了30～40 ℃時(shí)6種抗生素的分離情況,研究表明,柱溫升高可以明顯加快各抗生素的出峰時(shí)間,改善峰形,因?yàn)殡S著溫度升高,溶質(zhì)的容量因子減小,其減小的程度與溶質(zhì)的焓變有關(guān),焓變越大,溫度對保留的影響越大[32]。當(dāng)溫度為40 ℃時(shí),目標(biāo)物出峰時(shí)間快,峰形較好,但SMX和ENR出現(xiàn)峰交叉,分離度較差(見圖4a);隨著溫度降低,SMX和ENR開始逐漸分離,目標(biāo)物出峰時(shí)間也相應(yīng)減慢;到32 ℃時(shí),6種抗生素得到最好的分離效果,且出峰時(shí)間穩(wěn)定在30 min以內(nèi)(見圖4b),在批量實(shí)驗(yàn)時(shí)可以減少分析時(shí)間。

圖 4 不同柱溫下6種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the standard solution of thesix antibiotics at different column temperaturea. 40 ℃; b. 32 ℃

2.4 線性范圍與檢出限

配制0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照前述的色譜條件進(jìn)行檢測,以色譜峰面積(y)對抗生素質(zhì)量濃度(x, mg/L)作校正曲線后,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。采用3倍信噪比得出檢出限(LOD), 10倍信噪比得出定量限(LOQ)[25]。結(jié)果見表3,6種抗生素在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性,其r2均≥0.999 9。

2.5 添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別在0.50 g雞糞樣品中加入5、10、50 μg/g的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混好的樣品在黑暗條件下靜置24 h,使二者充分接觸,盡量模擬真實(shí)樣品。每個(gè)添加水平重復(fù)3次,按優(yōu)化后的提取方法和色譜條件進(jìn)行試驗(yàn),計(jì)算各目標(biāo)抗生素的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明,該方法在低、中、高3個(gè)添加水平下的回收率達(dá)到70.0%～116.3%之間(見表3),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～16.6%。

表 3 6種抗生素的添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, mg/L

2.6 實(shí)際樣品的檢測

按照上述分析方法對遼寧省撫順市某養(yǎng)雞場雞糞樣品中的6種抗生素含量進(jìn)行了檢測。通過多點(diǎn)取樣,采集該養(yǎng)雞場當(dāng)天新鮮雞糞樣品5份,冷凍干燥,研磨過篩后按照上述預(yù)處理提取和檢測方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明,雞糞樣品中喹諾酮類和磺胺類抗生素均被檢出。喹諾酮類抗生素因半衰期較長總含量最高,達(dá)到1.57～16.92 mg/kg。NOR和ENR均被檢出,含量分別為未檢出～9.23 mg/kg和1.57～7.69 mg/kg。磺胺類抗生素總含量在2.02～13.05 mg/kg之間,其中SMZ的含量為2.02～13.05 mg/kg。SMX、OTC和TCT未檢出。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合固相萃取法和高效液相色譜法,建立了一種同時(shí)檢測雞糞中四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素的方法。該方法高效、低成本,能夠準(zhǔn)確地對樣品中的抗生素進(jìn)行定量分析,適用于畜禽糞便中多種類抗生素的快速檢測,對抗生素污染評估和治理具有重要意義。