雜化硅膠整體材料研磨法制備混合型高效液相色譜固定相

王照地,張 璐,郭丙倩,王世革,黃明賢

(上海理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系, 上海 200093)

隨著生物學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展,對(duì)高效液相色譜(HPLC)分離分析方法的要求越來(lái)越高。色譜柱是HPLC的核心,不同性能的填料是HPLC廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。以硅膠為基質(zhì)的固定相是目前應(yīng)用最為廣泛的HPLC填料[1-3]。這主要是因?yàn)楣枘z微球具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、合適的孔結(jié)構(gòu)和理想的比表面積、穩(wěn)定的形貌,以及其微球表面含有豐富的硅羥基可以很方便地進(jìn)行化學(xué)鍵合和表面修飾[4]。硅膠的顆粒大小、孔徑分布及其比表面積等都是影響色譜分離效果的重要因素。常見(jiàn)的硅膠制備方法有硅酸鹽酸化法[5]、溶膠-凝膠法[6]、噴霧干燥法[7]、堆砌硅珠法[8]等。硅酸鹽酸化法會(huì)引入一些金屬雜質(zhì)導(dǎo)致填料具有催化活性和非特異吸附性。溶膠-凝膠法和噴霧干燥法制備硅膠時(shí)要求的工藝參數(shù)比較復(fù)雜,需要對(duì)各個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇。堆砌硅珠法制備的硅膠微球孔結(jié)構(gòu)是硅膠微粒的間隙,其孔徑受限于硅溶膠膠粒的大小。

硅膠整體材料是以烷氧基硅烷為主要原料,采用溶膠-凝膠工藝制備而成的無(wú)機(jī)整體材料。硅膠整體材料具有機(jī)械強(qiáng)度高,穩(wěn)定性好,孔隙率高,并且含有豐富的硅羥基,易于化學(xué)修飾與鍵合等優(yōu)點(diǎn),因此可被用來(lái)做快速分析的HPLC固定相。溶膠-凝膠法是一種制備材料的濕化學(xué)方法,這種制備方法可以在低溫等工藝條件較溫和的情況下,通過(guò)化學(xué)方法控制和調(diào)整材料的微觀結(jié)構(gòu),制得的材料具有高純度、高均勻性、可重復(fù)性等特點(diǎn)。在微柱色譜分析領(lǐng)域,通過(guò)溶膠-凝膠工藝在毛細(xì)管中形成硅膠整體材料[9]是一個(gè)常用的方法;在此過(guò)程中可引入不同的有機(jī)官能團(tuán),它們不參與反應(yīng)而是直接引入到硅膠表面制得有機(jī)-硅膠雜化整體材料[10]。多種硅烷化試劑可被用來(lái)制備雜化整體材料,比如辛基三乙氧基硅烷(C8-TES)[11-13]、苯基三乙氧基硅烷(PTES)[14,15]等等。但是,常見(jiàn)的毛細(xì)管整體柱[16-18]應(yīng)用到HPLC分析系統(tǒng)時(shí)對(duì)色譜儀器有較高的要求。Joung等[19]和Faiz等[20,21]將硅膠整體材料研磨得到彎曲型和分叉型等不規(guī)則形狀的硅膠顆粒,這些形狀的硅膠顆粒相對(duì)于傳統(tǒng)的球形硅膠顆粒在相近粒徑情況下有著柱壓低和通透性好等優(yōu)點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)快速、高效的色譜分離效果。由此,整體柱領(lǐng)域的豐富研究成果就可以應(yīng)用到一般HPLC填充色譜柱的制備中來(lái)。在本工作中,我們完成了一鍋法引入有機(jī)官能團(tuán)制備出雜化硅膠整體材料,經(jīng)球磨機(jī)研磨得到粒徑大小和比表面積均合適的硅膠顆粒,然后對(duì)顆粒表面進(jìn)行化學(xué)修飾制備混合型HPLC固定相等一系列實(shí)驗(yàn)研究。

近年來(lái),有關(guān)混合模式色譜(mixed-mode chromatography)[22,23]的制備和應(yīng)用越來(lái)越受到重視,其中最常見(jiàn)的是具有正交性質(zhì)的反相和離子交換的結(jié)合[24,25]。Dabre等[26]制備出一種新型的反相/弱陰離子交換固定相,使得多種維生素達(dá)到很好的分離效果。彭西甜等[27]利用一種辛基-羧基共同修飾的反相/弱陽(yáng)離子交換色譜柱,實(shí)現(xiàn)了多種表面活性劑、藥物、堿性溶質(zhì)分子混合物的基線分離。王曉歡等[28]制備了一種苯基-苯磺酸共同鍵合的反相/強(qiáng)陽(yáng)離子交換混合色譜固定相,應(yīng)用于幾種堿性藥物的分離。唐濤等[29]以十八烷基三氯硅烷和3-巰丙基三甲氧基硅烷為原料,制備了一種C18-磺酸基團(tuán)共同修飾鍵合的反相/強(qiáng)陽(yáng)離子交換混合色譜柱填料,實(shí)現(xiàn)了多種苯的同系物和若干種核苷的基線分離,還對(duì)牛血清蛋白(BSA)的酶解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了有效的分離?；旌夏Ｊ椒聪嗳蹶?yáng)離子交換(RP/WCX)色譜具有疏水和弱陽(yáng)離子交換的保留機(jī)理,結(jié)合了兩者的優(yōu)勢(shì),可以解決傳統(tǒng)反相液相色譜(RPLC)中堿性化合物分離效果差和色譜峰過(guò)載的問(wèn)題。鑒于此,本文制備了一種含C18和羧酸基團(tuán)的反相和弱陽(yáng)離子交換(RP/WCX)混合模式色譜固定相,并考察了其反相保留作用能力和對(duì)堿性藥物的分離作用和保留行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量20 000)、四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、11-巰基十一烷酸、普魯卡因、利多卡因、普萘洛爾購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尿素、乙酸、咪唑、甲醇、乙醇、異丙醇等(均為分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲苯、三氯甲烷購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;C18(十八烷基二甲基氯硅烷)購(gòu)自美國(guó)Gelest公司;反向測(cè)試樣品購(gòu)自大連依利特公司;偶氮二異丁腈購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

230Ⅱ系列高壓液相色譜儀和EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站(大連依利特分析儀器有限公司); VEGA3掃描電子顯微鏡(SEM)和元素能譜分析(EDS)(泰思肯貿(mào)易上海有限公司); Tristar Ⅱ 3020比表面與孔徑分析儀(美國(guó)Micromeritics公司);行星式球磨機(jī)(長(zhǎng)沙德科儀器設(shè)備有限公司);液相色譜裝柱機(jī)(深圳正大流體機(jī)電設(shè)備有限公司), KSL箱式高溫?zé)Y(jié)爐(合肥科晶材料技術(shù)有限公司),電熱鼓風(fēng)干燥箱和真空干燥箱購(gòu)自上海-恒科學(xué)儀器有限公司,KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)NUAIRE公司), XL30傅里葉變換紅外光譜儀(荷蘭Philips公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1雜化硅膠整體材料的制備

在盛放30 mL 0.01 mol/L乙酸溶液的反應(yīng)釜內(nèi)襯中,加入3.24 g聚乙二醇和3.30 g尿素,在0 ℃的冰水浴中攪拌10 min,加入10.0 mL的四甲氧基硅烷和3.3 mL的乙烯基三甲氧基硅烷,繼續(xù)攪拌40 min;然后將反應(yīng)釜置于40 ℃的環(huán)境下反應(yīng)48 h,接著在120 ℃的環(huán)境中反應(yīng)48 h,即得到硅膠整體材料。將硅膠整體材料用水和乙醇分別清洗2次,在70 ℃下干燥20 h。

1.2.2硅膠整體材料的研磨

調(diào)整球磨機(jī)的研磨條件,將打碎的硅膠整體材料研磨2 h后,收集硅膠顆粒,用水、乙醇和甲醇分別離心洗滌2次后在60 ℃真空干燥24 h。

1.2.3硅膠顆粒的Tris處理

稱取5.4 g Tris溶于150 mL水中,加入6.0 g研磨離心洗滌干燥后的硅膠顆粒,加入乙酸調(diào)節(jié)溶液的pH為9;然后將其放在155 ℃干燥箱中反應(yīng)10 h,待反應(yīng)完畢后,用水和甲醇分別離心洗滌硅膠顆粒2次,最后在70 ℃真空干燥8 h。

1.2.4表面鍵合

稱取經(jīng)Tris處理的干燥的SiO2顆粒4.0 g,置于250 mL三頸圓底燒瓶中,并加入120 mL甲苯,于油浴鍋中磁力攪拌,并升溫至110 ℃使甲苯回流20 min去除燒瓶中的水分,然后加入1.6 g咪唑(Im),攪拌15 min后用滴液漏斗在20 min內(nèi)加入3.6 g十八烷基二甲基氯硅烷和30 mL甲苯的混合溶液,繼續(xù)攪拌懸浮液8 h。將反應(yīng)液冷卻至室溫,待沉降后,過(guò)濾除去清液,加入100 mL甲苯洗滌固體顆粒,依次用45 mL甲醇、甲醇-水(1∶1,體積比)混合液和甲醇離心洗滌。最后將所得顆粒在60 ℃真空干燥12 h,得到表面鍵合C18的硅膠固定相(ML-ODS)。

取上述鍵合C18的硅膠顆粒2.0 g,置于250 mL三頸燒瓶中,加入150 mL甲苯,氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌并加熱至70 ℃,然后加入1.0 g 11-巰基十一烷酸和0.35 g偶氮二異丁腈(AIBN),磁力攪拌反應(yīng)8 h。待反應(yīng)液冷卻至室溫并沉降后,過(guò)濾除去清液,加入100 mL甲苯洗滌固體顆粒,依次用45 mL甲醇、甲醇-水(1∶1,體積比)混合液和甲醇離心洗滌,最后在60 ℃真空干燥12 h,得到C18和羧酸基團(tuán)共同修飾的雙配體混合模式硅膠固定相(MM-OCS)。

1.2.5色譜柱的裝填

采用高壓勻漿法裝柱。稱取適量微球樣品(干重1.8 g),超聲均勻分散于50 mL異丙醇-三氯甲烷(1∶1, v/v)混合溶液中,在35 MPa的壓力下,以甲醇為頂替液,將固定相填充到150 mm×4.6 mm的色譜柱中。

1.2.6色譜條件

反相應(yīng)用測(cè)試的色譜分離條件:流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25, v/v);檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為25 ℃。

堿性藥物的色譜分離條件:流動(dòng)相為乙腈-50 mmol/L NaH2PO4(50/50, v/v, pH=7.0);檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠顆粒的制備過(guò)程和反應(yīng)機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)以聚乙二醇為致孔劑,四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷為硅膠前驅(qū)體,在乙酸和尿素加熱分解提供的堿性環(huán)境催化作用下,硅烷水解縮聚得到雜化硅膠整體材料。經(jīng)球磨機(jī)研磨后得到粒徑大小合適的硅膠顆粒,經(jīng)Tris處理后,得到具有合適孔徑的硅膠。

本實(shí)驗(yàn)探究了不同硅源的影響。由于四甲氧基硅烷的水解速率大于四乙氧基硅烷,且文獻(xiàn)[30]報(bào)道以四甲氧基硅烷為硅源,易于形成孔徑分布窄、比表面積大的結(jié)構(gòu)。因此常采用四甲氧基硅烷制備硅膠整體材料。以四甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷混合物為硅源得到的硅膠雜化整體材料硬度太大,使用球磨機(jī)研磨時(shí)得到的顆粒大小不均勻,并且經(jīng)掃描電鏡觀察到顆粒大小分布范圍較廣,形狀極不規(guī)則。以四甲氧基硅烷和巰基三甲氧基硅烷混合物為硅源時(shí),反應(yīng)時(shí)有明顯的分層現(xiàn)象,不能形成理想的帶有官能團(tuán)的硅膠整體材料。以四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷混合物為硅膠前驅(qū)體時(shí),得到的雜化硅膠整體材料具有類(lèi)似于四甲氧基硅烷單獨(dú)作為硅膠前驅(qū)體時(shí)較滿意的結(jié)果。

圖 1 MM-OCS的制備過(guò)程Fig. 1 Schematic procedure for the preparation of MM-OCSIm: imidazole; Tol: toluene; AIBN: azodiisobutyronitrile.

雜化硅膠整體材料的形成過(guò)程以及后續(xù)的表面修飾可用圖1來(lái)說(shuō)明。C18硅烷鍵合后,再利用硅膠顆粒表面的乙烯基提供的雙鍵與11-巰基十一酸中的巰基發(fā)生Thiol-ene點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)[31-33],從而制備了含C18和羧基的固定相MM-OCS。

2.2 固定相的表征

2.2.1掃描電鏡

以四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷混合物為硅膠前驅(qū)體,制備得到的雜化硅膠整體材料經(jīng)球磨機(jī)研磨后可以得到形狀比較均勻的無(wú)定型顆粒。圖2a是整體柱經(jīng)研磨后,Tris處理前的硅膠;圖2b是Tris處理后的硅膠顆粒。Tris處理是為了使硅膠表面更均勻,并使孔徑略有增加。因?yàn)門(mén)ris溶液是弱堿性的,在水熱反應(yīng)條件下,對(duì)硅膠有一定的腐蝕和溶解作用,然而Tris溶液又催化硅羥基的縮聚和硅膠的形成,從而引起硅膠表面結(jié)構(gòu)的重整。(reorganization of the silica network)[34]。

圖 2 Tris處理(a)前、(b)后硅膠顆粒的SEM照片F(xiàn)ig. 2 Scanning electron microscope (SEM) images of the prepared silica particles (a) before and (b) after Tris treatment

2.2.2元素分析

對(duì)固定相MM-OCS制備過(guò)程中的各步產(chǎn)物進(jìn)行了元素分析,結(jié)果如表1所示。鍵合前硅膠含有C元素,表明雜化硅膠含有乙烯基。C18鍵合后以及硫醇與烯的點(diǎn)擊化學(xué)(Thiol-ene click chemistry)反應(yīng)后的固定相中含有的C元素含量增加,并且在固定相MM-OCS中發(fā)現(xiàn)S元素,表明十八烷基二甲基氯硅烷和11-巰基十一烷酸均已成功鍵合到硅膠表面。

表 1 固定相MM-OCS制備過(guò)程中各產(chǎn)物的元素分析結(jié)果

2.2.3BET測(cè)試

不同四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷的體積比會(huì)造成硅膠孔徑和比表面積的不同(見(jiàn)表2)。

表 2 采用不同體積比的四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷

由表2可看出,隨著乙烯基三甲氧基硅烷用量的增加,所制得的硅膠顆粒粒徑增大,由此可以判斷乙烯基三甲氧基硅烷使得雜化硅膠整體材料的硅膠骨架的直徑變大,并且使其硬度增加。同時(shí),隨著乙烯基三甲氧基硅烷量的增加,所得到的硅膠顆?？讖綔p小,比表面積增加。當(dāng)四甲氧基硅烷與乙烯基三甲氧基硅烷比例為3∶1時(shí),孔徑大小與比表面積大小與常用的HPLC硅膠基質(zhì)接近,并且粒徑均勻、大小合適,能滿足高壓液相色譜填料的一般需要。由圖3可以看出硅膠顆粒主要孔徑變化范圍為6～12 nm,但Tris處理后通過(guò)對(duì)硅膠表面的硅氧鍵的降解和重排使硅膠孔徑有所增加。這些硅膠顆粒的孔徑主要來(lái)源于原雜化硅膠整體材料的微孔,整體材料的制備方法保證了所得到的硅膠顆粒具有一定的比表面積和相應(yīng)的鍵合量,有助于提高色譜柱的分離效果。

圖 3 硅膠顆粒的孔徑分布曲線Fig. 3 Pore size distribution curves of the silica particles

圖 4 硅膠顆粒的紅外光譜圖Fig. 4 FTIR spectra of silica particles

2.2.4紅外表征

采用紅外光譜對(duì)固定相MM-OCS制備過(guò)程中的各步產(chǎn)物進(jìn)行了表征,結(jié)果見(jiàn)圖4。3 445 cm-1處的吸收峰是殘余硅羥基和未充分干燥的水的吸收峰。2 930 cm-1和2 860 cm-1兩處的吸收峰分別為亞甲基的不對(duì)稱與對(duì)稱收縮吸收峰,這是鍵合到硅膠表面的十八烷基硅烷與11-巰基十一烷酸中的亞甲基產(chǎn)生的。1 718 cm-1為羰基的伸縮振動(dòng)峰,1 610 cm-1為碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)峰,可以推斷硅膠顆粒經(jīng)Tris處理前后,雙鍵仍然保留。1 085 cm-1為硅氧鍵的伸縮振動(dòng)峰,并且此處MM-OCS的峰略寬,這是CO-OH與Si-O鍵振動(dòng)疊加的結(jié)果。以上結(jié)果表明,C18和羧基已成功鍵合到硅膠表面。

2.3 硅膠顆粒的色譜性能評(píng)價(jià)

2.3.1反相色譜測(cè)試

利用混合樣品對(duì)固定相ML-ODS和MM-OCS進(jìn)行反相色譜評(píng)價(jià)。從圖5和表3可見(jiàn),5種化合物得到很好的分離,并且峰形對(duì)稱。ML-ODS柱和MM-OCS柱是基于同一批鍵合C18的固定相,但是由圖5和表3可以看出ML-ODS柱的反相保留時(shí)間比MM-OCS長(zhǎng)一些,其原因可能是ML-ODS柱的硅膠表面既有C18又有乙烯基,所以反相保留能力較強(qiáng);而MM-OCS柱的硅膠表面雙鍵已被修飾成十一烷酸,其所帶的羧基使得固定相表面的極性增強(qiáng),從而減弱其反相保留能力。表3中的理論塔板數(shù)(N)和塔板高度(H)與一般相近粒徑的硅膠色譜柱相當(dāng)。

圖 5 ML-ODS和MM-OCS在反相模式下分離混合樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatogram of the mixed sample on ML-ODS and MM-OCS stationary phases in reversed-phase mode

表 3 ML-ODS和MM-OCS固定相分離混合樣品的色譜參數(shù)

tr: retention time;N: theoretical plate number;H: theoretical plate height.

圖 7 待測(cè)堿性藥物的結(jié)構(gòu)Fig. 7 Structures of basic drugs to be tested

由圖6的van Deemter曲線可以看出乙苯在ML-ODS和MM-OCS兩種柱上的塔板高度隨著流速的增加先減小后增加,最后趨于平緩,在0.5 mL/min時(shí)達(dá)到最小。與一般球型ODS柱相比,這種硅膠材料由于其特殊的形狀(彎曲型,分叉型等)使得材料通透性好,在高流速狀態(tài)下,塔板高度變化不大,因此可以進(jìn)行快速HPLC分析,體現(xiàn)了此種硅膠顆粒的優(yōu)勢(shì)。

圖 6 乙苯在兩種色譜柱(150 mm×4.6 mm)上的van Deemter曲線Fig. 6 van Deemter curves of ethylbenzene obtainedon two columns (150 mm×4.6 mm) Mobile phase: MeOH/H2O (75∶25, v/v). Injection volume: 10 μL. Detection wavelength: 254 nm. HETP: height equivalent to a theoretical plate.

圖 8 ML-ODS和MM-OCS分離堿性藥物色譜圖Fig. 8 Chromatogram of basic drugs on ML-ODS/MM-OCS stationary phase Mobile phases: CAN-50 mmol/L NaH2PO4(50∶50, v/v) at pH 7.0. Peaks: 1. thiourea; 2. procaine; 3. lidocaine; 4. propranolol.

2.3.2離子交換性能測(cè)試評(píng)價(jià)

選取幾種堿性藥物(見(jiàn)圖7)進(jìn)行分離評(píng)價(jià),由圖8可以看出在ML-ODS柱上,當(dāng)流動(dòng)相處于中性(pH=7)緩沖液條件下時(shí),這幾種堿性藥物不能被分開(kāi),其主要原因是這幾種堿性藥物的極性或親水性比較強(qiáng),它們與固定相ML-ODS的作用弱。但是在MM-OCS柱上,這幾種藥物卻有很好的保留和分離效果,說(shuō)明混合型固定相中的羧基產(chǎn)生了離子交換作用;同時(shí),堿性比較強(qiáng)的普萘洛爾雖然出現(xiàn)拖尾峰,但是可以在色譜柱上有所保留且可以達(dá)到有效的分離。采用前沿色譜的方法使用在ML-ODS柱上不保留而在MM-OCS柱上有保留的堿性普魯卡因進(jìn)一步測(cè)定了制備的固定相MM-OCS的離子交換當(dāng)量[35],計(jì)算得到普魯卡因在MM-OCS色譜柱的離子交換當(dāng)量為560 μg/g。

3 結(jié)論

本研究發(fā)展了一種利用溶膠-凝膠法得到雜化硅膠整體材料,并通過(guò)球磨機(jī)研磨和Tris處理,制備均勻、粒徑為3 μm左右、孔徑在7.5 nm左右硅膠顆粒的方法。以掃描電子顯微鏡、BET、紅外光譜、元素分析等表征手段對(duì)所制備的新型硅膠顆粒進(jìn)行了測(cè)試和表征,提供了硅膠制備的優(yōu)化條件。對(duì)所制備的硅膠顆粒進(jìn)行了C18鍵合和巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)得到混合型的硅膠固定相,并對(duì)其進(jìn)行了反相色譜和離子交換色譜性能評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果表明這種高壓液相色譜填料的制備方法簡(jiǎn)便,粒徑和孔徑容易控制,填充柱的通透性好,可以實(shí)現(xiàn)快速分析,從而滿足不同HPLC分離分析應(yīng)用的需要和促進(jìn)HPLC固定相的發(fā)展。