利拉魯肽對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號通路的影響

張梅，石秀英，李林娟，薛亞妮

隨著社會的進步，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的改變，日常攝入的高脂高熱量食物增多，使得非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發(fā)病率顯著升高[1]。NAFLD的主要特征為肝細胞脂肪變性和脂肪蓄積，同時患者無過量飲酒史[2]。NAFLD 疾病譜包括單純性非酒精性脂肪肝，嚴重患者會發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎或肝纖維化以及肝硬化，甚至發(fā)展為肝細胞癌[3]。胰島素JNK1信號通路是激活炎性反應(yīng)的主要影響因素之一。Smith等[4]研究表明：JNK1基因敲除可以減輕炎癥及高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和肝脂肪變，達到防止肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化的效果。利拉魯肽(liraglutide)是長效人胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1，GLP-1)的類似物，與GLP-1具有同源性，由食物刺激小腸 L 細胞分泌[5-6]。相比其類似物GLP-1，利拉魯肽有效半衰期延長，作用持久，不經(jīng)過肝臟、腎臟降解排泄，使得利拉魯肽備受關(guān)注。楊穎博等[7]研究表明：當機體出現(xiàn)高血糖時，利拉魯肽能刺激胰島素分泌，同時能夠抑制胰高血糖素分泌；在機體出現(xiàn)低血糖時，利拉魯肽能夠減少胰島素分泌。同時利拉魯肽可以通過抑制食欲、延緩胃排空、增加飽腹感等多種機制抑制脂肪在肝臟堆積。本文旨在研究利拉魯肽對NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號通路的影響，以期了解利拉魯肽對NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號通路的作用機理，從而為NAFLD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

選取40只6周齡SPF級大鼠，體質(zhì)量170～230 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，普通級，分8個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只。飼養(yǎng)于醫(yī)學(xué)院動物中心實驗室。

1.2 藥物與試劑

利拉魯肽(商品名：諾和力；批號：DP51077)購自丹麥諾和諾德公司；胰島素受體抗體(貨號：ab5500)購自Abcam公司；C-Jun氨基端激酶1抗體 (貨號：CST3708)購自CST公司；磷酸化胰島素受體底物1抗體(貨號：CST9215)購自CST公司；磷酸化C-Jun氨基端激酶1抗體 (貨號：CST2381)購自CST公司；β-actin抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司。

1.3 儀器

低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；光學(xué)顯微鏡購自美國Thermo公司；721分光光度計購自美國sigma公司；恒溫水箱購自上海信帆生物科技有限公司；切片機購自德國Leica公司；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；ADVIA 2400 全自動生化分析儀購自德國西門子公司；電子天平購自上海精天天平廠產(chǎn)品。

2 方法

2.1 建立模型

選取30只大鼠隨機分為模型組、低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組，給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方見表1；另設(shè)10只大鼠為對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。持續(xù)18 d后，高脂飼料喂養(yǎng)的每組處死2只大鼠，根據(jù)朱曉寧等[7]研究得出的方法判斷建立NAFLD大鼠模型是否成功。該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準同意。

表1 大鼠飼料成分表

2.2 分組及藥物干預(yù)

根據(jù)建立模型時的處理方法上述大鼠被分為：對照組(control)、模型組(model)、低劑量利拉魯肽組(low lira)和高劑量利拉魯肽組(high lira)，其中模型組、低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組每組8只，對照組10只。低劑量利拉魯肽組使用0.6 mg/(kg·d)劑量的利拉魯肽腹腔注射，每日一次，次持續(xù)18 d；高劑量利拉魯肽組使用1.2 mg/(kg·d)劑量的利拉魯肽腹腔注射，每日一次，次持續(xù)18 d。

2.3 檢測項目

2.3 1 一般情況的觀察

準確稱量大鼠體質(zhì)量，處死大鼠后取其肝臟病監(jiān)測器肝臟濕重并計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟濕重/體質(zhì)量×100%。

2.3.2 測定大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS變化

嚴格按照全自動生化檢測儀使用方法檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和血清胰島素(FINS)變化。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠肝組織中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

嚴格按照按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒測操作，測定大鼠肝組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及游離脂肪酸(FFAs)含量。

2.3.4 Western blot 檢測蛋白表達水平

按照Western blot 檢測方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對胰島素受體(IR)、磷酸化胰島素受體底物1(p-IRS1,Ser307位點)、C-Jun氨基端激酶1(JNK1)及磷酸化C-Jun氨基端激酶1(p-JNK1)蛋白質(zhì)條帶灰度進行相對定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對表達水平。實驗重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

2.3.5 染色觀察大鼠肝臟組織變化

將大鼠處死后取大鼠肝臟組織經(jīng)過固定、沖洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、染色、封片、烘干等步驟處理后，使用蘇木精-伊紅染色，毎張切片光鏡下觀察 5 個視野，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)變化

由表2可以看出，相比對照組，模型組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)顯著增加，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組；兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)變化檢測

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.2 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS含量檢測

由表3可以看出，相比對照組，模型組大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量顯著增加，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)BG含量無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)BG含量則無顯著變化(P>0.05)。

表3 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS檢測

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠肝組織中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

由圖1可以看出，相比對照組，模型組大鼠SOD含量顯著降低、TNF-α、MAD和FFAs含量顯著升高，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠SOD含量顯著升高，且高劑量利拉魯肽組顯著高于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠TNF-α、MAD和FFAs含量顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 大鼠肝臟組織中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表達檢測

由圖2可以看出，相比對照組，模型組大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表達顯著升高，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IR表達無顯著差異(P>0.05)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表達顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IR表達無顯著差異(P>0.05)。

3.5 HE染色觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化

由圖3可以看出，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰，肝臟中央靜脈大且壁薄，肝細胞呈放射狀分布，且肝細胞呈多邊形，大小一致且排列整齊，肝竇和核結(jié)構(gòu)清晰可見。模型組大鼠組肝細胞腫脹，出現(xiàn)重度彌漫性肝細胞大泡性脂肪變，在肝細胞內(nèi)部部分小葉內(nèi)有壞死灶，且以淋巴細胞為主的炎癥細胞出現(xiàn)浸潤，部分出現(xiàn)點狀壞死和灶狀壞死。低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組肝細胞明顯較高脂組肝細胞體積縮小，未見脂肪變性，肝小葉內(nèi)未見炎癥。

圖1大鼠肝組織TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量測定 與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖2大鼠肝組織中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表達檢測 與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；A為對照組；B為模型組；C為低劑量利拉魯肽組；D為高劑量利拉魯肽組

4 討論

IR與NAFLD的發(fā)病有著密切的關(guān)系， JNK1蛋白在在肥胖引起的IR中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[9]。邱涵等[10]研究證明：胰島素信號傳導(dǎo)時，胰島素會和細胞表面胰島素受體結(jié)合，使得胰島素受體活化導(dǎo)致JNK1信號通路中的受體蛋白磷酸化。胰島素受體底物主要有多種異構(gòu)體，最重要的是IRS-1，這種異構(gòu)體可以其介導(dǎo)胰島素信號傳導(dǎo)發(fā)生障礙并且使得使胰島素作用的外周靶組織均發(fā)生IR。Nishina等[11]研究表明，JNKI活化介導(dǎo)了IRS1-中的Ser3O7磷酸化并且使得IRS-1對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)節(jié)作用，并且增加了胰島素的敏感性。本實驗中可以發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中胰島素敏感組織脂肪等JNK活性明顯升高，使用利拉魯肽作用后大鼠JNK 1及p-IRS1顯著降低，說明利拉魯肽可以有效地抑制JNK信號通路，且抑制NAFLD的發(fā)生，這和石志平等[12]研究結(jié)論相一致。

圖3大鼠肝臟組織病理學(xué)變化(HE，×400) A為對照組；B為模型組；C為低劑量利拉魯肽組；D為高劑量利拉魯肽組

目前診斷NAFLD的方法較多[13]，其中血清 ALT 水平是無創(chuàng)性診斷方法中重要的一種生化指標?；羟偾俚萚14]研究表明，利拉魯肽可以減輕高脂誘導(dǎo)的肝脂肪變同時降低肝組織炎癥指標水平達到治療NAFLD的作用。劉麗波等[15]臨床研究證明，NAFLD患者使用 GLP-1類似物干預(yù) 12 周后，血清 ALT 水平明顯下降。本實驗中可以發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清ALT含量顯著升高，使用利拉魯肽處理后，ALT含量顯著降低，說明利拉魯肽可以有效降低肝臟組織中的炎癥，達到緩解和治療NAFLD的作用。帖彥清等[16]研究表明，NAFLD患者中，由于肝內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，使得過氧化產(chǎn)物如丙二醛(MAD)含量增加，并且會使得患者機體的抗氧化能力減弱，導(dǎo)致肝細胞膜和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，同時也會使得大鼠的肝組織游離脂肪酸(FFAs)水平明顯升高，誘發(fā)肝細胞死亡導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和細胞功能障礙[17]。MAD的含量可以反映機體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解，由此可以得知MAD的含量可間接反映出細胞損傷的程度。本實驗中可以看出，模型組大鼠體內(nèi)MAD及FFAs含量顯著升高，使用利拉魯肽處理后MAD及FFAs含量顯著降低，說明利拉魯肽可以有效降低大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且可以有效降低脂質(zhì)氧化產(chǎn)物并降低肝臟細胞的炎癥，達到緩解NAFLD的作用，與龐曉寧等[18]的結(jié)論一致。

綜上所述，利拉魯肽可以有效的抑制NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號通路并對肝功能起到保護作用，其作用機制可能與降低JNK1的表達以及抑制JNK1的磷酸化有關(guān)。但因NAFLD涉及到的信號通路及蛋白較多，在后續(xù)的實驗中可以進一步探討利拉魯肽通過其他信號通路及蛋白的表達對NAFLD的治療效果及作用機理。