基于選區(qū)激光熔融技術(shù)制備的多孔鈦合金支架的力學(xué)性能及成骨能力評價*

孫允龍 康紅磊 林坷升 關(guān)邯峰 劉潔 李鋒*

自20 世紀50 年代起，各類骨科植入物的成功應(yīng)用揭開了骨科疾病終末期治療的新篇章，以Ti6-Al4-V 為代表的鈦合金由于具有高耐腐蝕性及良好的生物相容性成為制備骨科植入物最常用的材料。經(jīng)過長期的臨床隨訪，人們發(fā)現(xiàn)將鈦合金植入物應(yīng)用于承重部位時常出現(xiàn)植入物的無菌性松動和植入物周圍骨折。這主要是因為Ti6-Al4-V 的機械性能顯著超越骨組織，植入物周圍的骨質(zhì)因應(yīng)力遮擋效應(yīng)而發(fā)生再吸收[1-2]。解決這個問題的首要方法是降低材料的彈性模量，與研發(fā)新材料相比，改變原材料的空間結(jié)構(gòu)是一種簡便易行的手段。開放的多孔材料不僅可以獲得較低的相對密度，有利于植入物的輕量化，而且可以增加植入物的表面積，有利于血管生成和骨組織長入，促進宿主骨與植入物間的生物融合進程[3]。天然骨是一種復(fù)雜的多孔結(jié)構(gòu)，它由外層致密緊實的骨皮質(zhì)（孔隙率較低，5%～10%）和內(nèi)層疏松多孔的骨松質(zhì)（孔隙率較高，50%～90%）構(gòu)成，了解這種復(fù)合多孔材料的機械性能對于新植入物的開發(fā)是必要的，理想的骨科植入物也應(yīng)由類似的復(fù)合多孔材料組成[4]?，F(xiàn)如今，人們已經(jīng)可以通過增材制造（additive manufacturing，AM）技術(shù)制備復(fù)雜的多孔結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究也表明，AM 技術(shù)制備的多孔鈦合金支架擁有令人滿意的力學(xué)性能及骨整合能力，但此類研究的對象往往圍繞均一多孔結(jié)構(gòu)展開，主要研究不同孔徑及不同孔隙率的多孔鈦合金支架在力學(xué)性能及骨整合能力間的差異[5]。針對復(fù)合多孔結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能及骨整合能力的研究仍處于起步階段。因此，本文通過將復(fù)合多孔結(jié)構(gòu)、均一多孔結(jié)構(gòu)及傳統(tǒng)鍛件進行對比，分別對其力學(xué)性能及成骨能力展開評價，為未來的植入物設(shè)計提供參考。

1 材料與方法

1.1 均一、復(fù)合多孔鈦合金支架的設(shè)計及制備

在CAD 軟件中構(gòu)建直徑為10 mm，高度為4 mm 的圓柱體模型，并以菱形正二面體為基本結(jié)構(gòu)單元，賦予圓柱體兩種不同的多孔結(jié)構(gòu)。均一多孔組（簡稱均一組）：結(jié)構(gòu)單元尺寸為2 mm，梁柱直徑為400 m 的均一多孔結(jié)構(gòu)；復(fù)合多孔組（簡稱復(fù)合組）：在均一組的基礎(chǔ)上再復(fù)合結(jié)構(gòu)單元尺寸為4 mm，梁柱直徑為800 m 的均一多孔結(jié)構(gòu)。每組多孔結(jié)構(gòu)的孔徑由微孔的內(nèi)接球直徑確定（見圖1A）。利用選區(qū)激光熔融（selective laser melting，SLM）技術(shù)制備上述兩組多孔鈦合金支架，所用鈦合金粉末（Ti6-Al4-V）平均粒徑為70 m，激光功率為140 W，掃描速度為300 mm/s，掃描間距為60 m，層厚為35 m。選用同規(guī)格的鍛造Ti6-Al4-V 試樣作為對照組。

圖1 多孔鈦合金支架的設(shè)計思路：A.均一、復(fù)合多孔結(jié)構(gòu)設(shè)計思路；B.電鏡照片；C.Ti6-Al4-V 粉末的微觀結(jié)構(gòu)及粉末的粒徑分布圖

1.2 力學(xué)性能測試

利用萬能試驗機（AGS-X，島津，日本）評價上述兩種多孔Ti6-Al4-V 合金支架的彈性模量及抗壓強度。針對直徑10 mm、高4 mm 的圓柱形試樣以1 mm/min 的速度進行壓縮試驗，多孔鈦合金支架的彈性模量由應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性區(qū)域確定。測量每組中的3 個樣本以獲得機械參數(shù)的平均值。

1.3 體外細胞相容性評價

1.3.1 體外細胞培養(yǎng)

利用兔來源的骨髓間充質(zhì)干細胞（rabbit-derived bonemarrow mesenchymalstemcells RBMSCs，Cyagen，美國）測試兩組支架的細胞黏附及促細胞增殖能力，實驗共重復(fù)3 次，每組材料每次實驗中使用3 個樣品。將RBMSCs 培養(yǎng)在有含有10%FBS（Hyclone，美國）和雙抗（鏈霉素100 g/mL，青霉素100U/mL；Hyclone，美國）的-MEM（GIBCO，美國）培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2的環(huán)境中每2d 更換生長培養(yǎng)基。

1.3.2 細胞黏附實驗及增殖實驗

兩組支架每組取3 個樣品放入24 孔板中，按1×105個細胞/孔接種RBMSCs，在37℃，5%CO2的生長培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h。在評估之前，將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）（博士德，中國）評估活細胞數(shù)，使用ELX800 吸光度酶標儀（Bio-Tek，美國）在450 nm 處測量吸光度（OD）；每組取3 個樣品放入24 孔板中，按1×104個細胞/孔接種RBMSCs，在37℃，5%CO2的生長培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d，用同樣的方法測量吸光度[6]。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)

將支架置于24 孔板中并按每孔1×104個細胞接種RBMSCs，然后在37℃，5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)6 h。小心地除去生長培養(yǎng)基后，將支架用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3 次，加入2.5%戊二醛溶液，4℃環(huán)境中避光過夜，然后在梯度濃度乙醇溶液中脫水（30%、50%、75%、90%和100%），每個梯度持續(xù)15 min，低溫干燥后噴金。

1.3.4 成骨分化評估

將支架置于 24 孔板中并按1×104個細胞/孔接種RBMSCs，在37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)7 d。細胞接種3 d后，棄去生長培養(yǎng)基并更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（HUXMA-90021，Cyagen，美國），每2 d 更換培養(yǎng)基。堿性磷酸酶（ALP）是成骨細胞分化的標志。成骨誘導(dǎo)7 d 后使用ALP 活性檢測試劑盒（P0321，碧云天，中國）檢測每組的ALP 活性。

1.4 體內(nèi)植入實驗

所有的實驗均嚴格按照動物實驗要求進行，且得到華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.4.1 植入物制備

兩組多孔鈦合金支架分別制成直徑4 mm，長度40 mm的圓柱體植入物，選取同規(guī)格的鍛造Ti6-Al4-V 植入物作為對照組。高溫高壓消毒后備用（見圖2A）。

1.4.2 實驗動物

健康新西蘭大白兔24 只，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院動物中心提供，非孕、哺乳期，平均體重（2.8±0.3）kg。實驗動物分組：均一組（n=8，雙側(cè)股骨髁植入均一多孔植入物）；復(fù)合組（n=8，雙側(cè)股骨髁植入復(fù)合多孔植入物）；對照組（n=8，雙側(cè)股骨髁植入鍛造Ti6-Al4-V 植入物）。所有實驗動物在手術(shù)前至少適應(yīng)2 周。

1.4.3 動物手術(shù)

戊巴比妥鈉（3%，1 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈注射用于麻醉的初始化和維持。將新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)處毛發(fā)剃除，然后用乙醇（75%）消毒。經(jīng)髕骨內(nèi)側(cè)入路暴露股骨髁間窩，用磨鉆在生理鹽水冷卻下沿著股骨長軸磨穿髁間窩處骨皮質(zhì)，將植入物插入其指定位置后縫合組織及皮膚。術(shù)后3 d 碘伏消毒切口并應(yīng)用青霉素預(yù)防感染（見圖2B）[7]。

圖2 A.植入物外觀（以均一組為例）；B.手術(shù)示意圖

1.4.4 Micro-CT 檢查

術(shù)后2 周復(fù)查X 線片明確植入物位置并于術(shù)后3 個月時通過空氣栓塞處死動物，將雙側(cè)股骨取下固定于福爾馬林溶液中。高分辨率Micro-CT（Scanco Viva CT 40，瑞士）用于分析骨長入情況。按照30 m 的分辨率對股骨遠端進行掃描并進行重建。在相同的閾值下分析骨體積分數(shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。利用獨立樣本t 檢驗及單因素方差分析進行數(shù)據(jù)比較，當(dāng)P＜0.05 時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多孔鈦合金支架的外觀及力學(xué)性能

利用掃描電鏡（SEM）觀察Ti6-Al4-V 支架的空間結(jié)構(gòu)并進行能譜分析，圖1B 顯示SLM 成形后的Ti6-Al4-V 支架外觀符合設(shè)計預(yù)期。能譜分析顯示SLM 制備的Ti6-Al4-V支架具有明顯的Ti、Al 和V 峰，未見其他元素峰，表明在制造過程中沒有發(fā)生污染。Ti、Al、V 元素的重量百分比與標準Ti6-Al4-V 合金相接近（見圖3）。機械性能評價，均一組多孔鈦合金支架與復(fù)合組相比較，屈服強度從115.2 MPa降低到75.9 MPa（P＜0.05），平均彈性模量從3.5 GPa 降低到2.1 GPa（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)如表1 所示。總的來說，本研究制備的兩組多孔鈦合金支架的彈性模量都與人體骨組織接近。

圖3 多孔Ti6-Al4-V 支架能譜分析

2.2 體外細胞黏附、增殖情況、形態(tài)學(xué)和成骨分化評估

每個觀察時間點多孔鈦合金支架的細胞黏附情況如圖所示（圖4A），隨著時間的推移，均一組與復(fù)合組間細胞黏附數(shù)量并無顯著差異，表明細胞遷移能力在短時間內(nèi)不受孔徑的影響。隨著時間的推移，細胞數(shù)量增加（見圖4B），統(tǒng)計學(xué)分析表明，多孔鈦合金支架的細胞活性在第1 d 和第3 d沒有顯著差異，自第5 d 起，復(fù)合組多孔鈦合金支架的細胞數(shù)量多于均一組（P＜0.05）。因此，可以推斷SLM 制備的多孔Ti6-Al4-V 合金支架具有良好的細胞相容性。利用電鏡觀察培養(yǎng)6 h 后支架上RBMSCs 的形態(tài)，細胞主要位于梁柱的間隙。細胞形態(tài)變平并擴散良好，具有許多絲狀偽足延伸（見圖4C）。第7 d，各組均檢測到ALP 活性，復(fù)合組多孔鈦合金支架優(yōu)于均一組。14 d 時，兩組支架的ALP 活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖4D）。

表1 多孔Ti6-Al4-V 支架的力學(xué)性能

圖4 體外細胞黏附、增殖情況，形態(tài)學(xué)和成骨分化評估：A.細胞黏附情況；B.細胞增殖情況；C.SEM觀測多孔鈦合金支架中RBMSCs形態(tài)；D.ALP 活性情況。*表示均一組與復(fù)合組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；#表示對照組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）

2.3 體內(nèi)植入實驗結(jié)果

術(shù)后所有的動物都恢復(fù)良好，整個實驗過程中未發(fā)生植入物移位和切口感染。植入物周圍未觀察到不良反應(yīng)。三維重建圖像提示多孔鈦合金支架周圍有新生骨組織形成，且與宿主骨緊密結(jié)合（見圖5A、圖5B、圖5C）。均一組與復(fù)合組骨體積分數(shù)間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均優(yōu)于對照組（P＜0.01）（見圖5D）。

圖5 體內(nèi)植入實驗結(jié)果：A.術(shù)后2 周復(fù)查情況；B.術(shù)后3 個月Micro-CT 掃描圖像，可見宿主骨與植入物間緊密結(jié)合；C.三維重建效果，可見植入物周圍有新生骨形成；D.兩種鈦合金支架骨體積分數(shù)比較，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；E-G.分別為對照組、均一組、復(fù)合組骨長入情況。#表示對照組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）

3 討論

近年來，骨組織工程的發(fā)展強調(diào)需要進行空間結(jié)構(gòu)的設(shè)計，以便于骨組織與多孔鈦合金支架進行骨整合[9]。相關(guān)研究認為單元類型、孔徑和孔隙率等關(guān)鍵參數(shù)對多孔鈦合金支架的力學(xué)性能起到?jīng)Q定性作用[10]。為了優(yōu)化植入物和組織工程支架的設(shè)計，必須針對不同孔隙結(jié)構(gòu)的多孔鈦合金支架的機械和生物效能進行研究。隨著增材制造技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)制造過程中支架參數(shù)無法精確掌握的技術(shù)難題得以攻克，科研人員可以通過計算機輔助設(shè)計（CAD）技術(shù)進行支架的模型構(gòu)建，并利用SLM 技術(shù)得到工藝參數(shù)高度可控的多孔鈦合金支架[11]。Kaplan 等[3]通過研究證明，孔隙率和孔隙直徑不僅影響支架的機械性能，還可影響骨長入，多孔支架的孔隙率大于40%，孔徑大于300 m 可實現(xiàn)令人滿意的血管形成和骨長入。在這里，筆者設(shè)計的兩種多孔鈦合金支架均滿足上述要求。通過力學(xué)實驗測試，兩種鈦合金支架的機械性能與天然骨相接近，且遠低于鍛造鈦合金件（115 GPa），這有助于減輕應(yīng)力遮擋效應(yīng)[12]。本研究通過布爾運算將兩種均一孔隙結(jié)構(gòu)合成一種新的復(fù)合孔隙結(jié)構(gòu)，且兩種均一孔隙結(jié)構(gòu)均是基于同一種結(jié)構(gòu)單元生成的，彼此間在結(jié)構(gòu)單元尺寸上呈現(xiàn)倍數(shù)關(guān)系，這使得在新生成的復(fù)合孔隙結(jié)構(gòu)中構(gòu)成不同孔徑的粗細梁柱間的自然過渡，避免應(yīng)力集中現(xiàn)象。體外的細胞實驗證明兩種鈦合金支架的生物相容性良好，且細胞增殖實驗提示5 d 起復(fù)合孔隙組細胞數(shù)量多于均一孔隙組，造成這種現(xiàn)象是因為相比于均一孔隙組，復(fù)合孔隙組擁有更小的孔徑，這使得復(fù)合孔隙組鈦合金支架具有較低的滲透性。低滲透性使細胞懸液在通過鈦合金支架時遇到更大的阻力，使細胞有更多機會黏附在支架上[13]。ALP活性被評估為成骨細胞分化的早期標志物[14]，在成骨誘導(dǎo)的7 d，復(fù)合孔隙組材料的ALP 活性顯著高于均一孔隙組，但在14 d 時兩組孔隙材料間并無差異，Wieding J 等[15]指出細胞分化是由于機械生物刺激引起的，復(fù)合孔隙組的孔隙率及孔隙直徑均低于均一孔隙組，這表明有較多的細胞黏附于支架表面，這將使細胞接受更多的生物刺激并分化成成骨細胞。但隨著時間的推移，增殖的細胞會使孔隙封閉，內(nèi)部細胞因得不到充足的營養(yǎng)物質(zhì)而影響分化，這可能是導(dǎo)致成骨誘導(dǎo)14 d 時兩組支架的ALP 活性無明顯差異的原因。作為一種理想骨科植入物的空間結(jié)構(gòu)，骨與植入物間的結(jié)合強度對于穩(wěn)定性及植入物的長期使用至關(guān)重要。通過將上述兩種結(jié)構(gòu)制備的植入體植入新西蘭兔股骨內(nèi)，借助CT 均可觀察到多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)的內(nèi)向骨長入，新生骨按照多孔鈦合金支架的幾何結(jié)構(gòu)進行分布，這與文獻報道的結(jié)果相一致[6]。兩組結(jié)構(gòu)的骨體積分數(shù)間未見明顯差異，推測可能與較大的時間跨度有關(guān)，在后期的實驗中將縮小時間跨度，以期得到骨體積分數(shù)的動態(tài)變化情況。綜上，筆者在先前的研究基礎(chǔ)上通過將兩種均一孔隙復(fù)合的方式生成了新的孔隙結(jié)構(gòu)，新的復(fù)合孔隙多孔結(jié)構(gòu)同樣具有令人滿意的力學(xué)性能和骨整合能力，為新型骨科植入物的設(shè)計提供參考。