梓醇促大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的機(jī)制研究*

傅淑平，楊 麗，龔 理，李瀟瀟，袁 璟，王軍蒙，張榮華△

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023;2暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室, 廣東 廣州 510632;3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

梓醇(catalpol) 是中國藥典指定的地黃定性指標(biāo)，屬于環(huán)烯醚萜類化合物[1]。有研究顯示地黃提取物能改善骨質(zhì)疏松癥中的骨代謝情況，提高成骨細(xì)胞的增殖及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 活性，抑制破骨細(xì)胞的生成及溶骨活性[2]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)不同濃度梓醇有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖及向成骨細(xì)胞方向分化的作用，且在促BMSCs增殖過程中，可同時激活經(jīng)典及非經(jīng)典 Wnt 信號通路[3-4]，但其促BMSCs骨向分化的作用機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合大量研究所提示的Wnt信號通路是BMSCs骨向分化過程中的重要通路[5-6]這一線索，探討梓醇促大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級3月齡SD雌性大鼠，體重(200±5.0)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。合格證號：SCXK(滬)2013-0016。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 梓醇標(biāo)準(zhǔn)品購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，用天平稱取梓醇1 mg，溶解于10 mL DMEM完全培養(yǎng)基中，0.22 μm濾器過濾分裝，配制成為100 mg/L的母液，在以后的實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要稀釋。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；優(yōu)級胎牛血清(天津?yàn)笊锟萍加邢薰?；胰酶(Amresco)；地塞米松、β-糖蛋白(β-glycoprotein,β-GP)、維生素C、EDTA、DMSO 及茜素紅(Sigma)；ALP檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所)； TRIzol(Invitrogen)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱 (ThermoForma)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司) ；普通光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡(Leica)；Model 680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；Chromo 4 熒光定量PCR儀(MJ Research)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1梓醇促BMSCs骨向分化過程中對ALP活性的影響

2.1.1實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為對照(control)組、成骨誘導(dǎo)(osteoinduction)組和梓醇組，對照組加入DMEM完全培養(yǎng)液，成骨誘導(dǎo)組加入經(jīng)典骨向分化誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、10-8mol/L 地塞米松、50 mg/L VitC和10 mmol/L β-GP的DMEM 培養(yǎng)液)，梓醇組加2.0 mg/L梓醇培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

2.1.2細(xì)胞上清液中ALP活性的檢測 取生長良好的3代或4代細(xì)胞，以1×108/L接種于24孔板中，待細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d全量換液1次，于培養(yǎng)的第7、14和21天分別收集各實(shí)驗(yàn)組上清液，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行ALP活性檢測，每組各設(shè)6個復(fù)孔。以ALP活性為縱軸，天數(shù)為橫軸，繪制ALP活性的變化曲線，ALP活性用金氏單位表示，即100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。計(jì)算公式如下：

2.1.3ALP染色陽性率的檢測 按2.1.2所述方法培養(yǎng)細(xì)胞，14 d后消化各孔細(xì)胞，1 200 r/mim離心5 min，去上清，加入1 mL普通培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先置有無菌蓋玻片的6孔板中，充分貼壁6 h，采用改良鈣鈷法對爬片細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后于100倍鏡下，隨機(jī)選取不重復(fù)的8個視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算ALP陽性染色率：ALP陽性染色率(%)=(ALP染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2.2梓醇對BMSCs 礦化能力的影響 按2.1.2所述分組培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)至第21天時，棄去培養(yǎng)液，進(jìn)行茜素紅染色，染色后，置50倍鏡下觀察各組細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)，評價(jià)BMSCs的礦化能力。

2.3梓醇促BMSCs骨向分化過程中對BMSCs成骨基因及Wnt基因表達(dá)的影響 按2.1.2所述分組培養(yǎng)細(xì)胞，分別在培養(yǎng)后的第7、14和21天用TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，然后根據(jù)real-time PCR試劑盒操作步驟說明，逆轉(zhuǎn)錄RNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Runx2、骨鈣素(osteocalcin)、Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的Ct值，采用2-ΔΔCt(Livak)法計(jì)算成骨誘導(dǎo)組、梓醇組中靶基因相對于對照組增加或減少的倍數(shù)，評價(jià)梓醇對目的基因mRNA表達(dá)水平的影響。引物序列詳見表1。

表1 Real-time PCR引物信息表

R:forward; R:reverse.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各時點(diǎn)的組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若方差齊，則選用Bonferroni法進(jìn)行組間比較；若方差不齊，則選用Tamhane法進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梓醇對細(xì)胞上清液中ALP活性及ALP染色陽性率的影響

采用單因素方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組不同誘導(dǎo)時點(diǎn)ALP的活性，結(jié)果顯示：第7天時，成骨誘導(dǎo)組和梓醇組ALP活性均高于對照組(P<0.05)，且梓醇組低于成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)。第14天時，成骨誘導(dǎo)組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且此2組ALP活性均低于梓醇組 (P<0.05)。第21天時，梓醇組及成骨誘導(dǎo)組均高于對照組(P<0.05)，但前兩者之間比較，其ALP活性無差異，見表2。ALP染色陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，第14天時，梓醇組及成骨誘導(dǎo)組的ALP染色陽性率均大于對照組(P<0.05)，梓醇組與成骨誘導(dǎo)組無差別，見圖1。

Figure 1.The effect of catalpol on ALP positive cell percentage of BMSCs. Mean±SD.n=8*P<0.05vscontrol group.

圖1 梓醇對BMSCs中ALP染色陽性率的影響

表2 梓醇對ALP活性的影響

Table 2.The effect of catalpol on ALP activity (Mean±SD.n=6)

GroupTime (d)7 14 21 Control4.110±0.2377.110±0. 7376.680±0.483Osteoinduction7.470±0.132*8.090±0.6718.280±0.541*Catalpol6.130±0.415*#8.970±0.369*#8.860±0.251*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsosteoinduction group.

2 梓醇對BMSCs礦化能力的影響

干預(yù)21 d后，各實(shí)驗(yàn)組均有礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色法對其進(jìn)行染色計(jì)數(shù)后，采用單因素方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組中BMSCs礦化結(jié)節(jié)數(shù)，結(jié)果顯示，梓醇組及成骨誘導(dǎo)組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)均大于對照組(P<0.05)，且梓醇組與成骨誘導(dǎo)組無顯著差別，見圖2。

3 梓醇促BMSCs骨向分化中對Runx2和osteocalcin表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示：第7天時，成骨誘導(dǎo)組Runx2 mRNA表達(dá)量顯著高于對照組與梓醇組 (P<0.05)，而后兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第14天時，梓醇組Runx2 mRNA相對表達(dá)量高于對照組，但小于成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)；第21天時，對照組、梓醇組及成骨誘導(dǎo)組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組間osteocalcin mRNA相對表達(dá)量的比較結(jié)果顯示：在第7、14及21天3個時點(diǎn)，梓醇組、成骨誘導(dǎo)組均高于對照組，且梓醇組各時點(diǎn)均低于成骨誘導(dǎo)組 (P<0.05) ，見圖3。

Figure 2.The effect of catalpol on mineralization in BMSCs. Mean±SD.n=8*P<0.05vscontrol group.

圖2 梓醇對BMSCs礦化能力的影響

Figure 3.The effect of catalpol on the mRNA expression of Runx2 and osteocalcin in BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsosteoinduction group.

圖3 梓醇對Runx2及osteocalcinmRNA表達(dá)的影響

4 梓醇促BMSCs骨向分化中對β-catenin和Wnt3a mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示：第7天時，各實(shí)驗(yàn)組β-catenin mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第14、21天時，成骨誘導(dǎo)組和梓醇組均高于對照組(P<0.05)，其中第14天時，梓醇組β-catenin mRNA表達(dá)量低于成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)，第21天時，兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間Wnt3a mRNA相對表達(dá)量的比較結(jié)果顯示：第7天時，各實(shí)驗(yàn)組Wnt3a mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第14和21天時，成骨誘導(dǎo)組和梓醇組均高于對照組(P<0.05)，且梓醇組各時點(diǎn)均低于成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)，見圖4。

5 梓醇促BMSCs骨向分化中對Wnt5a和Wnt11 mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示：第7天時，梓醇組Wnt5a mRNA表達(dá)量高于對照組與成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)，而后兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第14天時，成骨誘導(dǎo)組和梓醇組均高于對照組(P<0.05)，且梓醇組Wnt5a mRNA表達(dá)量低于成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)；第21天時，成骨誘導(dǎo)組和梓醇組均高于對照組(P<0.05)，但前兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間Wnt11相對表達(dá)量的比較結(jié)果顯示：第7天時，各實(shí)驗(yàn)組Wnt11 mRNA相對表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第14天時，成骨誘導(dǎo)組低于對照組(P<0.05)，梓醇組高于對照組和成骨誘導(dǎo)組(P<0.05)；第21天時，梓醇組與成骨誘導(dǎo)組均低于對照組(P<0.05)，見圖5。

討 論

有研究顯示，在胚胎骨發(fā)育期的BMSCs凝集階段，Runx2表達(dá)缺失將造成無成骨細(xì)胞發(fā)生；Runx2基因敲除純合子小鼠完全缺乏骨組織，不僅無骨基質(zhì)和成骨細(xì)胞，而且也無髓腔形成；在BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，出現(xiàn)Runx2表達(dá)后，才啟動細(xì)胞分化“開關(guān)”，促使BMSCs發(fā)育為成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞，因此Runx2被認(rèn)為是BMSCs向成骨細(xì)胞系分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志[ 7-9]。Osteocalcin，即骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是一種僅由成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞合成的VitK依賴酶修飾的非膠原蛋白，主要沉積在骨組織的細(xì)胞外間質(zhì)，一般在鈣化早期開始表達(dá)，鈣結(jié)節(jié)成熟后達(dá)高峰，是成骨細(xì)胞分化成熟和進(jìn)入礦化期的主要指征之一[10]。

Figure 4.The effect of catalpol on the mRNA expression of β-catenin and Wnt3a in BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsosteoinduction group.

圖4 梓醇對β-catenin和Wnt3a mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of catalpol on the mRNA expression of Wnt5a and Wnt11 in BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsosteoinduction group.

圖5 梓醇對Wnt5a和Wnt11 mRNA表達(dá)的影響

本課題組在前期研究中，通過檢測不同濃度梓醇對BMSCs細(xì)胞增殖及骨向分化的影響時，發(fā)現(xiàn)梓醇促BMSCs 增殖及骨向分化的最佳濃度分別為1.0 mg /L和2.0 mg /L，且經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號通路的激活參與了梓醇促BMSCs增殖的過程[3-4]，但其促BMSCs骨向分化的具體作用機(jī)制卻并不明確。為探討梓醇促BMSCs骨向分化的可能機(jī)制，本研究在驗(yàn)證梓醇可增加BMSCs ALP活性，促進(jìn)BMSCs礦化的基礎(chǔ)上，觀察梓醇對骨向分化關(guān)鍵因子Runx2及osteocalcin表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)組BMSCs從第7天開始，其Runx2與osteocalcin表達(dá)量就明顯高于對照組，且均在第14天時達(dá)到峰值；隨后開始下降，第21天時osteocalcin表達(dá)量仍高于對照組，但Runx2與對照組無差異。梓醇促BMSCs 骨向分化過程中，Runx2 mRNA表達(dá)水平也是第14天時達(dá)到峰值，隨后開始下降，第21天時與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；osteocalcin mRNA相對表達(dá)量在第7天時就高于對照組，隨后持續(xù)上升直至第21天。梓醇組中Runx2 mRNA表達(dá)量在第7和14天時均低于成骨誘導(dǎo)組，第21天時兩者無差異；但梓醇組中osteocalcin mRNA表達(dá)量在3個時點(diǎn)均低于成骨誘導(dǎo)組。這些結(jié)果說明梓醇培養(yǎng)液可通過上調(diào)Runx2和osteocalcin表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，增加細(xì)胞鈣沉積，促進(jìn)成骨作用的形成，但其作用強(qiáng)度低于化學(xué)誘導(dǎo)劑；體外培養(yǎng)的BMSCs可自動向成骨細(xì)胞方向分化，因此培養(yǎng)至一定時間后骨向分化標(biāo)志因子Runx2的表達(dá)不會再因誘導(dǎo)劑的作用而持續(xù)增加，此結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果相似[ 11]。

自從最初報(bào)道低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)變異可引發(fā)常染色體退行性病變骨質(zhì)疏松假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征，使患者骨量下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加以及骨骼畸形后[12]，越來越多的研究證實(shí)Wnt信號的經(jīng)典與非經(jīng)典通路在BMSCs骨向分化過程中具有重要的作用。Gong等[13]發(fā)現(xiàn)Wnt1、Wnt2和Wnt3a通過與其受體LRP5作用，增加β-catenin在核內(nèi)的積累，誘發(fā)ALP活性增加，參與骨向分化；保守型活化的β-catenin轉(zhuǎn)染亦可提高ALP活性。去除內(nèi)源性LRP抑制因子Dickkopf 和sclerostin，可增強(qiáng)體內(nèi)Wnt信號的功能，提高β-catenin累積量，刺激骨的形成[14-15]；當(dāng)小鼠體內(nèi)缺乏可溶性Wnt蛋白抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白1時，其成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的凋亡明顯下降，且從這種小鼠骨髓中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，其凋亡明顯降低的同時，其骨向分化能力、增殖能力卻明顯得到提高[16-17]。Bennett[18]、 Jackson等[19]則發(fā)現(xiàn)LiCl可以阻斷糖原合成酶激酶-3β酶活性，刺激BMSCs骨向分化，Wnt3a、Wnt1、Wnt10b、保守型活化的β-catenin均可以活化Wnt/β-catenin通路刺激成骨細(xì)胞的形成，而這一通路的抑制因子Dickkopf 蛋白1則可減少成骨細(xì)胞的形成，提示內(nèi)源性Wnt信號通路在成骨細(xì)胞的形成及骨形成中具有重要的作用。此外，Gaur等[20]還發(fā)現(xiàn)Runx2是Wnt/β-catenin/轉(zhuǎn)錄因子1(transcription factor 1, TCF1)信號的一個靶點(diǎn)，經(jīng)典Wnt信號通路可通過直接活化Runx2基因的表達(dá)而增強(qiáng)BMSCs的骨向分化能力。此外，Boland等[21]發(fā)現(xiàn)，Wnt11在BMSCs骨向分化時表達(dá)上調(diào)；而Wnt5a對骨的形成有促進(jìn)的作用。Boyan等[6]則發(fā)現(xiàn)，Wnt11為Wnt5a上游基因，可通過上調(diào)Wnt5a的表達(dá)，促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化，這些都提示我們經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路參與調(diào)節(jié)BMSCs骨向分化過程。本研究通過檢測不同干預(yù)時點(diǎn)BMSCs中Wnt3a、β-catenin、Wnt5a及Wnt11 mRNA情況，探討梓醇促BMSCs骨向分化過程中對經(jīng)典及非經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)因子的影響。結(jié)果表明，在經(jīng)典骨向分化誘導(dǎo)液與梓醇培養(yǎng)液干預(yù)下，BMSCs內(nèi)Wnt3a和β-catenin mRNA表達(dá)量在第14和21天時均顯著提高，但梓醇組中Wnt3a表達(dá)量在這2個時點(diǎn)均低于成骨誘導(dǎo)組，β-catenin表達(dá)量在第14天時低于成骨誘導(dǎo)組，第21天時，兩者之間無差異。說明梓醇及骨向分化誘導(dǎo)液在誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的過程中激活了Wnt經(jīng)典信號通路。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：梓醇組中BMSCs內(nèi)Wnt5a mRNA表達(dá)量在第7天時就高于對照組，并在整個培養(yǎng)周期內(nèi)均處于高表達(dá)狀態(tài)；成骨誘導(dǎo)組在第7天時與對照組無差異，第14天時達(dá)到高峰，且高于梓醇組，隨后開始下降，至第21天時與梓醇組處于同一水平。就Wnt11相對表達(dá)量而言，第7天時，各實(shí)驗(yàn)組之間無差異；第14天時梓醇組中Wnt11相對表達(dá)量顯著上升，高于對照組；而成骨誘導(dǎo)組則顯著下降，低于對照組；至21天時，梓醇組Wnt11表達(dá)量快速下降，與成骨誘導(dǎo)組持平，且均低于對照組。從這個結(jié)果中，我們看到經(jīng)典骨向分化誘導(dǎo)液在促BMSCs骨向分化過程中并未提高Wnt11的表達(dá)；梓醇在第14天時表現(xiàn)出顯著提高BMSCs Wnt11表達(dá)量的作用，且這一作用持續(xù)時間并不長，在第21天時又低于對照組。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)到所指出的Wnt11表達(dá)的上升可能主要出現(xiàn)在BMSCs骨向分化的早期或中期，在細(xì)胞進(jìn)入礦化后，其表達(dá)量下降[21]這一提示，以及本研究中所觀測到的成骨誘導(dǎo)組在第7天時，Runx2基因相對表達(dá)量就已高于對照組，我們推測經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液促BMSCs向成骨方向分化的誘發(fā)時點(diǎn)可能早于第7天，因此錯過了其Wnt11相對表達(dá)量的高峰期。此外，在第21天時成骨誘導(dǎo)組、梓醇組細(xì)胞Wnt11表達(dá)量均低于對照組的現(xiàn)象，可能是由于BMSCs在體外自然培養(yǎng)過程中，細(xì)胞緩慢地向成骨細(xì)胞方向分化，Wnt11表達(dá)逐步提升，而成骨誘導(dǎo)組、梓醇組的細(xì)胞均已處于礦化期，Wnt11表達(dá)量下降所致，由此也提示我們Wnt11表達(dá)量的上升應(yīng)該主要是在BMSCs骨向分化早中期。

綜上所述，我們認(rèn)為梓醇通過上調(diào)Runx2和osteocalcin的表達(dá)，同時增加ALP的分泌沉積，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化及新生成骨細(xì)胞的成熟，此作用可能與其同時激活經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)，但其具體作用途徑有待進(jìn)一步研究。