阿昔替尼對腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細胞生物學(xué)行為的影響*

楊濤瑋，汪幫琦，胡衛(wèi)列△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2中國解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州510010)

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenal cortical carcinoma，ACC)是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤，每年發(fā)病率約為0.5～2.0/100萬人，該病起病隱匿，惡性程度高，侵襲力強，容易向肝臟、肺、后腹膜及淋巴轉(zhuǎn)移[1-3]。完全性手術(shù)切除是早期ACC治療的重要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，即使完全切除腫瘤，患者5年生存率僅為30%。ACC缺乏有效的藥物治療，目前國內(nèi)外推薦最有效的藥物米托坦，其有效率僅為35%，且僅能短暫減緩腫瘤進展速度[4]。

阿昔替尼(axitinib)為小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，可靶向作用于血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，具有抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤細胞生長的作用[5-6]。目前臨床上阿昔替尼主要用于腎癌的治療，少有在ACC治療中應(yīng)用。本文研究阿昔替尼是否可抑制人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細胞的生長，并探究其作用機理，為阿昔替尼臨床用于ACC治療提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞株

人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細胞購自上海中科院細胞庫。

2 主要試劑

阿昔替尼購自MedChemExpress；L-15培養(yǎng)基(杭州吉諾公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜、青霉素和鏈霉素(Gibco)；CCK-8細胞活力檢測試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Dojindo)；細胞周期檢測試劑盒(武漢碧云天公司)；兔抗人β-actin、兔抗人VEGFR 2、p-ERK 1/2和ERK1/2 抗體(Abcam)。

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的L-15培養(yǎng)基、接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，在37 ℃、無CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞密度處于70%～80%時進行傳代；用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。一般2 d換液，4 d細胞傳代。

3.2CCK-8法檢測細胞存活率 將對數(shù)生長期的SW-13細胞以2.5×107/L密度接種于96孔板中，每孔含培養(yǎng)液100 μL，設(shè)置5個藥物實驗組(阿昔替尼濃度分別為0.1、1、2.5、5、10和20 μmol/L)、1個正常對照組和1個空白組，每組4個復(fù)孔。在受試物處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光反應(yīng)4 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm波長的吸光度(A)值，以空白對照孔調(diào)零，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)×100%。實驗獨立重復(fù)3次。

3.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將細胞接種傳代于6孔板中，每孔細胞接種約5×104個，待細胞鋪滿板底約60%時棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板2次，分組并更換含受試物的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)細胞48 h。按細胞周期檢測試劑盒標準操作流程，消化收集并固定細胞，染色后上BD流式細胞儀檢測。實驗獨立重復(fù)3次。

3.4Annexin V/PI雙染法檢測SW-13細胞凋亡 取處于對數(shù)生長期SW-13細胞接種于6孔板(每孔5×104細胞)，待細胞鋪滿板底約60%時棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板2次，分別換相應(yīng)受試物培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室溫下避光染色15min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

3.5劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 將24孔板背面橫向畫線，每孔3條。對數(shù)生長期細胞消化并均勻接種于孔板內(nèi)，培養(yǎng)細胞密度為細胞間無空隙。用直尺比劃，以100 μL槍頭沿直尺固定，垂直于孔板背后畫線，對孔板細胞筆直劃痕。用PBS沿孔板邊輕沖洗細胞3次，吸去劃下的細胞，對照組加入無血清L-15培養(yǎng)基，藥物組分別加入無血清含有4、8和16 μmol/L藥物的培養(yǎng)基。放入上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，分別于18 h和36 h在相差顯微鏡下選定同一位置拍照，計算細胞遷移率。

3.6Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將對數(shù)生長期細胞撤血清饑餓培養(yǎng)過夜。消化細胞、離心，并分別用無血清培養(yǎng)基及含4、8和16 μmol/L阿昔替尼藥物的無血清培養(yǎng)基重懸細胞。調(diào)整細胞濃度至1×108/L。分別取細胞懸液200 μL加入Transwell小室，小室下孔板內(nèi)加入500 μL含30%FBS的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液，將Transwell小室取出，用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)細胞及基質(zhì)膠，無水甲醛固定小室外側(cè)細胞20 min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min，PBS沖洗小室內(nèi)外側(cè)3次。在倒置相差顯微鏡，計數(shù)5個隨機視野的細胞數(shù)量。

3.7Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收集阿昔替尼處理48 h的SW-13細胞至離心管中，充分裂解細胞，利用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，進行12%SDS-PAGE分離，使用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，脫脂乳室溫封閉1 h，加人 I 抗兔抗人β-actin抗體、兔抗人VEGFR2 抗體、兔抗人p-ERK 1/2抗體及兔抗人ERK1/2 抗體，置于4℃搖床過夜孵育。用TBST洗滌5次，每次5 min，加入II抗(HRP標記山羊抗兔IgG)，室溫孵育1h，ECL發(fā)光試劑顯色，利用化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶，內(nèi)參照采用β-actin，利用ImageJ軟件進行灰度分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

各組實驗獨立重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用 SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。細胞活力和劃痕愈合實驗結(jié)果采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni檢驗；細胞周期、細胞侵襲實驗、細胞凋亡率和Western blot結(jié)果分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法檢測阿昔替尼對SW-13細胞生長的抑制作用

以0 μmol/L阿昔替尼作為對照組，結(jié)果顯示，同一時點，隨阿昔替尼濃度增加，細胞存活率明顯降低(P<0.05)；同一藥物濃度，隨作用時間延長，細胞存活率也顯著降低(P<0.01)，見圖1，即阿昔替尼抑制SW-13細胞增殖呈濃度-時間相關(guān)性。計算出阿昔替尼作用24 h、48 h和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(19.06±1.09) μmol/L、(6.49±0.03) μmol/L和(4.13±0.04) μmol/L。

Figure 1.The effect of axitinib on the viablility of SW-13 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;##P<0.01vs24 h group.

圖1 阿昔替尼對SW-13細胞活力的影響

2 阿昔替尼阻滯SW-13細胞周期

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組S期無明顯變化，處于G0/G1期細胞的比例減少(P<0.01)，而G2/M細胞的比例明顯升高(P<0.01)，見圖2。表明阿昔替尼對細胞周期有抑制作用，可將SW-13阻滯在G2/M期。

3 阿昔替尼促進SW-13細胞凋亡

Annexin V/PI雙染色流式細胞檢測結(jié)果顯示，對照組細胞凋亡率為(3.50±0.42)%，1 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組細胞凋亡率分別為(3.80±0.60)%、(9.80±1.08)%和(17.90±2.17)%。與對照組比較，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖3。

4 阿昔替尼減弱SW-13細胞遷移能力

對照組在18 h和36 h后，細胞已明顯向劃痕區(qū)遷移并覆蓋劃痕空白條帶，而阿昔替尼干預(yù)后，能夠顯著抑制 SW-13細胞向劃痕區(qū)的遷移。Two-way ANOVA分析，除4 μmol/L組在18 h遷移率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性外，其余各阿昔替尼組遷移率和對照組相比均顯著降低(P<0.01)，見圖4。提示阿昔替尼可減弱SW-13細胞遷移能力，且阿昔替尼抑制細胞弱遷移的能力和其作用時間和藥物濃度呈正比關(guān)系。

Figure 2.The effect of axitinib on the cell cycle distribution of SW-13 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 阿昔替尼對SW-13細胞周期的影響

Figure 3.Axitinib induced apoptosis in the SW-13 cells. The SW-13 cells treated with Axitinib were stained with annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3 阿昔替尼對SW-13細胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of axitinib on migration ability of SW-13 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4 劃痕愈合實驗檢測阿昔替尼對細胞遷移能力的影響

5 阿昔替尼抑制SW-13細胞侵襲能力

Transwell小室外側(cè)的SW-13細胞數(shù)量，8和16 μmol/L阿昔替尼組較對照組明顯減少(P<0.01)，見圖5。結(jié)果表明阿昔替尼可以抑制SW-13細胞對組織基質(zhì)的侵襲能力。

6 阿昔替尼抑制VEGFR2介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化

Western blot結(jié)果示,與對照組相比，阿昔替尼呈劑量依賴性地抑制VEGFR2的表達；p-ERK1/2在用藥后的蛋白水平明顯降低(P<0.01)，而ERK1/2的表達無明顯差異,見圖6。提示阿昔替尼抑制前列腺癌細胞的活力和遷移可能與調(diào)控VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平相關(guān)。

Figure 5.The effect of axitinib on the invasion ability of SW-13 cells(×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5 阿昔替尼對細胞侵襲能力的影響

Figure 6.The effects of axitinib on the protein levels of VEGFR2 and p-ERK1/2 in SW-13 cells was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖6 阿昔替尼對SW-13細胞VEGFR2和p-ERK1/2蛋白表達水平的影響

討 論

腎上腺皮質(zhì)癌是原發(fā)于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤。據(jù)研究報道ACC年發(fā)病率為0.02%[1-3]。ACC起病隱匿，腎上腺皮質(zhì)癌組織形態(tài)在影像學(xué)上和正常腎上腺組織相似，影像學(xué)診斷困難。有功能ACC腫瘤其臨床表現(xiàn)與腎上腺良性腫瘤表現(xiàn)相似，容易誤診漏診；而無功能型ACC更難以被發(fā)覺；多數(shù)ACC患者被診斷時已有遠處轉(zhuǎn)移。失去手術(shù)機會的ACC患者，需要使用化療、放療、腫瘤栓塞等姑息治療方法，然而這些治療效果都不理想。即使是早期ACC患者施行根治性切除術(shù)，也需要術(shù)后服用藥物來防止腫瘤復(fù)發(fā)[7]。

米托坦作為FDA唯一批準使用的ACC治療藥物，其有效率僅為35%[4]，且米托坦并不能使ACC患者遠期生存率顯著提高。尋找耐受好、療效佳的治療ACC的藥物已成為人們關(guān)注的焦點。近年來酪氨酸酶抑制劑相關(guān)靶向藥物，如VEGFR抑制劑等，成為了抗腫瘤靶點研究熱點，但VEGFR是否也可能是ACC理想的治療靶點，目前文獻很少。阿昔替尼作為多靶點酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，其主要作用的受體為VEGFR、PDGFR和c-KIT，可通過酪氨酸激酶受體抑制作用，阻斷受體型酪氨酸激酶相關(guān)信號通路，使腫瘤細胞失去繼續(xù)分裂和生長的能力[5-6]。Kroiss等[8]在157例腎上腺皮質(zhì)癌和9例正常腎上腺組織樣品中利用免疫組織化學(xué)檢測了VEGF和VEGFR的表達發(fā)現(xiàn)，VEGFR2在ACC組織中表達量較正常腎上腺組織顯著增高，同時發(fā)現(xiàn)舒尼替尼可以抑制ACC細胞系的增殖，并通過下調(diào)HSD3B2表達來抑制腎上腺皮質(zhì)癌細胞皮質(zhì)醇的分泌。文獻報道索拉菲尼(sorafenib)，另一種TKI，可通過有效抑制VEGFR1、VEGFR2和PDGFR，顯著抑制腎上腺皮質(zhì)癌細胞的生長，表明其在腎上腺皮質(zhì)癌細胞中具有抗血管生成和抗腫瘤作用[9]，以上研究表明酪氨酸酶抑制劑類可能通過抑制VEGFR，繼而抑制腫瘤增殖及血管生成，達到治療ACC的目的。本研究中，我們通過CCK-8法來檢測阿昔替尼對SW-13細胞活力的抑制作用。結(jié)果表明，隨著藥物濃度的升高或藥物作用時間的增長，SW-13細胞存活率降低，藥物抑制SW-13細胞活力呈濃度和時間雙重依賴性。值得注意到的是，阿昔替尼24 h的半抑制濃度(IC50)為19.06 μmol/L，在24 h～48 h期間IC50有顯著下降，而48 h和72 h的IC50較為穩(wěn)定，分別為6.491μmol/L和4.125μmol/L，推測可能由于24 h時細胞尚處于第一個分裂周期，此后細胞分裂受到抑制，故48 h后的IC50變小，即很低濃度的藥物即可抑制細胞的活力?？梢酝茰y，阿昔替尼對腫瘤細胞的作用主要是通過抑制其生長，而可能并不主要是通過殺傷細胞導(dǎo)致的。以上推測在分析細胞周期和細胞凋亡的實驗中得到了進一步的證實。本研究中流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，阿昔替尼可劑量依賴地將SW-13細胞阻滯于G2/M期，使得細胞不能進入M期，導(dǎo)致分裂指數(shù)下降，細胞增殖被抑制；而G2/M期阻滯可能也是DNA的修復(fù)期，損傷的DNA在染色體分離前可能得到修復(fù)，而不能修復(fù)者則退出增殖周期，進入凋亡途徑[10]。本研究結(jié)果，阿昔替尼用藥48 h后，SW-13細胞的凋亡率明顯升高，也證明了這一點。但其促凋亡作用似沒有周期阻滯作用明顯，是否阿昔替尼在抑制SW-13細胞活力的過程中，相對促進其細胞凋亡而言，藥物對細胞周期生長的阻滯更加重要，還尚需進一步證明。

惡性腫瘤除了增殖、細胞周期和細胞凋亡等基本生長繁殖特征外，其生物學(xué)特征還包括轉(zhuǎn)移特性。本研究劃痕愈合實驗顯示，阿昔替尼可減弱SW-13細胞遷移能力，并且隨作用時間延長或藥物濃度增高，減弱遷移能力的效果越明顯。Transwell實驗也證實阿昔替尼抑制了SW-13細胞的侵襲能力。這兩個實驗互相佐證，證明了阿昔替尼可以降低SW-13細胞的遷移、侵襲能力，這是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要藥物特征。

如前所述，酪氨酸激酶抑制劑是ACC治療的潛在重要靶點。其中VEGFR相關(guān)通路可能通過影響腫瘤增殖、血管生成等達到治療腫瘤的目的。VEGF配體通過結(jié)合到VEGFR2上，催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到Ras蛋白酪氨酸殘基上，激活Ras，然后進一步激活PARK級聯(lián)反應(yīng)：Raf1→MEK1/2→ERK1/2[11]。MAPK/ERK信號通路，不僅在細胞增殖、細胞凋亡、遷移等過程中起到重要作用，也處于血管生成信號通路的調(diào)節(jié)中心，決定腫瘤血管生成的最終狀態(tài)[12]。ERK分為ERK1和ERK2，主要通過磷酸化而激活為有活性的p-ERK1/2，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和血管形成過程，并在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Sun等[12]研究表明，一種抗血管生成化合物EPOX可以通過抑制ERK磷酸化，從而具有抗腫瘤血管形成的作用。本實驗Western blot結(jié)果顯示，阿昔替尼減少了VEGFR2和p-ERK1/2的蛋白水平。可以推測，阿昔替尼下調(diào)VEGFR2表達，導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)Raf1→MEK1/2→ERK1/2抑制，從而抑制ERK的磷酸化這一機制可能與阿昔替尼體外抑制SW-13細胞活力有關(guān)。