黔東南州藍莓枝枯病的病原鑒定及不同品種的抗病性調(diào)查

(貴州大學(xué)，貴陽 550025)

藍莓原產(chǎn)于美洲，為杜鵑花科越桔屬種子植物，由于其果實含有豐富的花青苷、維生素、氨基酸以及鉀、鐵、鋅、鈣等微量元素，營養(yǎng)價值高，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，并且在醫(yī)療保健、化妝品和環(huán)境保護等方面應(yīng)用廣泛[2]。因而，現(xiàn)在各地廣為引種栽培。

黔東南州是貴州引種栽培藍莓最早、栽培面積最廣的地區(qū)，目前引種的藍莓品種多達9個，是貴州省有機藍莓生產(chǎn)的主要基地。隨著栽培面積的不斷增加和栽培時間的延長，藍莓病害的發(fā)生也越來越嚴重，藍莓枝枯病就是其中一種主要病害。藍莓枝枯病造成枝條枯死，嚴重的影響藍莓產(chǎn)量和品質(zhì)，是制約貴州省藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。準(zhǔn)確鑒定引發(fā)貴州省黔東南州藍莓枝枯病的病原菌，并查清不同藍莓品種對藍莓枝枯病的抗病性程度，是綠色防控藍莓枝枯病的理論基礎(chǔ)，是保障有機藍莓生產(chǎn)，提高果農(nóng)經(jīng)濟效益的重要舉措，對促進貴州省藍莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和果農(nóng)的脫貧致富具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

從黔東南州麻江縣和丹寨縣的藍莓果園(見表1)采集藍莓枝枯病發(fā)病標(biāo)本，帶回實驗室進行病原菌的分離、純化和鑒定，并且進行藍莓枝枯病的自然發(fā)病系統(tǒng)調(diào)查和人工接種鑒定。

表1 實驗材料

品種名稱采集地點奧尼爾麻江縣睿林藍莓基地藍宇麻江縣睿林藍莓基地粉藍麻江縣睿林藍莓基地園藍麻江縣睿林藍莓基地巨峰麻江縣睿林藍莓基地頂豐麻江縣恒道丹林藍莓基地杰兔丹寨縣興仁藍莓種植基地燦爛麻江縣烏羊麻藍莓標(biāo)準(zhǔn)園巴爾德溫麻江縣睿林藍莓基地

1.2 方 法

1.2.1病原菌的分離

采用組織分離法，從藍莓枝枯病標(biāo)本的病健交界處切下若干個0.2 cm×0.2 cm左右的組織塊，先用75%乙醇進行消毒處理后，再用無菌水漂洗2次，用鑷子取出并放在濾紙上吸干水分；放置在PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2致病性測定

按照柯赫氏法則，通過盆栽試驗，采用致傷接種的方法，將分離的微生物接種到健康的藍莓幼苗枝條上，正常培養(yǎng)該藍莓植株，等到接種枝條上出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，再次分離該發(fā)病部位的微生物。對比本次分離的微生物與接種時使用的微生物的形態(tài)特征，若一致，則確定分離到的微生物為引發(fā)藍莓枝枯病的病原菌。

注：A為成熟的分生孢子；B為PDA上的菌落背面；C為PDA上的菌落正面。圖1 棒狀擬盤多毛孢形態(tài)特征

1.2.3病原菌的鑒定

分別采用形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法鑒定病原菌。具體如下：

1) 病原菌形態(tài)鑒定方法。將分離純化的病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，利用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子的形態(tài)及著生方式，通過顯微鏡連接的電腦對分生孢子進行拍攝，并測量分生孢子大小。根據(jù)分生孢子的形態(tài)及著生方式確定其屬、種。

2) 病原菌分子生物學(xué)鑒定。病原菌DNA的提取；利用ITS通用引物 ITS 4和 ITS 5對病原菌基因組 DNA 進行 PCR 擴增，然后送樣至上海生工研究中心有限公司進行測序；測序和數(shù)據(jù)比對。經(jīng)專業(yè)的生物公司測序得到結(jié)果后，通過NCBI上的BLAST功能尋找所測序列的近似序列，然后與結(jié)果相比對，判斷是否一致，從而確定該地藍莓枝枯病的致病菌。

1.3 不同藍莓品種對枝枯病的抗病性調(diào)查

1.3.1自然發(fā)病調(diào)查

對黔東南州麻江縣和丹寨縣栽培的奧尼爾、藍宇等9個品種、3年生以上的藍莓植株，根據(jù)每個品種藍莓樹木群體的大小，按照5點取樣法或3點取樣法，進行藍莓枝枯病自然發(fā)病的系統(tǒng)調(diào)查；每個調(diào)查點，隨機取樣10株，調(diào)查各植株上的全部枝條是否有枝枯病發(fā)病。最后統(tǒng)計各品種的病枝率，初步判定這些品種的藍莓對枝枯病的抗病性程度。

1.3.2人工接種的抗病性鑒定

通過盆栽方法，對奧尼爾、藍宇、粉藍、園藍、巨峰、頂豐、杰兔、燦爛、巴爾德溫共9個品種的藍莓幼苗，以分離純化的藍莓枝枯病的病原菌——棒狀擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)為致病菌，采用致傷接種法，進行人工接種鑒定。接種后正常培養(yǎng)藍莓植株，于3周后進行抗病性調(diào)查，確定其抗病性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測定結(jié)果

對奧尼爾等9個藍莓品種上采集到的枝枯病標(biāo)本上分離到的微生物分別進行致病性測定。接種后，其癥狀均表現(xiàn)為：在接種處出現(xiàn)紅褐色病斑，隨后病斑不斷擴大變?yōu)楹稚詈笳麄€枝條干枯死亡。通過再次分離病原菌的分離及顯微鏡觀察，其分生孢子與自然條件下發(fā)病形成的分生孢子形態(tài)特征一致。由此可見，該分離所得的微生物就是引發(fā)黔東南州藍莓枝枯病的致病菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

分生孢子梗緊密排列在分生孢子盤內(nèi)，單個頂生，具膠狀粘稠物質(zhì)；分生孢子呈紡錘形，有5個細胞，具隔膜，中間分隔處較明顯[(21.5～25.2)μm×(5.6～6.2)μm]；兩端細胞均為無色，較透明，頂部細胞長度為3.0～3.6μm，基部細胞長度為2.9～3.5μm；中間細胞欖褐色，自頂端前2個細胞為深褐色，細胞壁厚，長度為11.0～11.7μm，后1個細胞顏色稍淡，長度5.6～5.9μm；頂生附屬絲2～4根，較長，長度為24.2～27.1μm，基部附屬絲僅1根，較短，長度為4.8～6.4μm(圖1)。并且，從奧尼爾等9個藍莓品種上采集到的枝枯病標(biāo)本上分離的微生物，其形態(tài)特征一致，初步判定，他們是同一個種的病原菌。

根據(jù)病原菌的培養(yǎng)特點和形態(tài)特征，確定引起黔南州藍莓枝枯病的病原菌為擬盤多毛孢(Pestalotiopsis)屬真菌，屬半知菌亞門(Deuteromycotina)、腔孢綱(Coelomycetes)、黑盤孢目(Melanconiales)。

2.3 病原菌分子鑒定

通過用引物ITS 4和 ITS 5進行PCR擴增檢測分析，得到了長度為527 bp的產(chǎn)物，通過BLAST搜索，與登錄號為FJ 517545.1的序列一致性為100%(Query cover為99%，Evalue=0)，這條序列的描述為擬盤多毛孢屬真菌(Pestalotiopsisclavispora)，結(jié)合形態(tài)，可以判定這就是引起黔南州藍莓枝枯病害的真菌棒狀擬盤多毛孢。

2.4 不同藍莓品種對枝枯病的抗病性

通過對黔東南州麻江縣和丹寨縣栽培的奧尼爾、藍宇等9個品種藍莓枝枯病的自然發(fā)病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，供試的9個品種均有枝枯病的發(fā)生，但是不同品種間，其病枝率差異比較明顯(見表2)。其中燦爛的病枝率最低，僅為8.5%；奧尼爾的病枝率最高，達到24.5%?？梢猿醪脚卸N爛、杰兔2個品種對藍莓枝枯病具有一定程度的抗病性。而奧尼爾、巨峰2個品種對藍莓枝枯病的抗病性程度相對最低；其他5個品種，對藍莓枝枯病的抗病性程度居中。

人工接種的抗病性鑒定表明，供試的9個品種，對棒狀擬盤多毛孢的侵染大多表現(xiàn)為感病(見表2)，僅燦爛、杰兔2品種表現(xiàn)為抗病。

表2 不同品種藍莓的枝枯病自然發(fā)病調(diào)查及其抗病性鑒定

藍莓品種自然發(fā)病病枝率(%)人工接種病枝率(%)抗病性程度粉藍17.5100感病園藍10.5100感病巨峰23.5100感病頂豐18.5100感病杰兔10.5100抗?fàn)N爛8.5100抗巴爾德溫21.5100感病藍宇22.5100感病奧尼爾24.5100感病

3 結(jié)論與討論

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，引發(fā)貴州黔東南州藍莓枝枯病的病原菌為棒狀擬盤多毛孢。奧尼爾等9個藍莓品種中，僅燦爛、杰兔2品種對棒狀擬盤多毛孢侵染藍莓引起的枝枯病具有一定程度抗病性。其余的奧尼爾、園藍等7個品種均對棒狀擬盤多毛孢呈感病表型。

藍莓枝枯病是藍莓生產(chǎn)中的重要病害之一，在世界各地的藍莓栽培中廣為發(fā)生。在世界范圍內(nèi)，藍莓枝枯病主要是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌引起，其病原菌包括Botryosphaeriacorticis、Neofusicoccumarbuti、Lasiodiplodiatheobromae、N.parvum、N.australe、N.ribis和B.dothidea等[2-5]。在國內(nèi)，對于引發(fā)藍莓枝枯病的病原菌，也有多種不同的報道。涂磊等研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)云南引起藍莓枝枯病的病原菌為子囊菌葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的小新殼梭孢[N.Parvum( Pennycook & Samuels) Crous,Slippers & A. J. L Phillips][6]。徐成楠等認為，藍莓枝枯病的病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[7]。金義蘭等研究結(jié)果表明，引發(fā)貴州黔東南州藍莓枝枯病的病原菌是擬莖點霉屬真菌(Phomopsissp.)[8]。趙洪海等[9]、路梅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)山東、浙江藍莓枝枯病的病原菌為棒狀擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)。張國輝等研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)貴州黔東南州藍莓枝枯病的病原菌是烏飯樹擬莖點霉(Phomopsisvaccinii)[11]。曾爾玲等研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)貴州省貴陽市藍莓枝枯病的病原菌是韋斯梅擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisvismiae)[12]。本研究結(jié)果與趙洪海等[9]、路梅等[10]的研究結(jié)果一致。由此可見，能夠引發(fā)藍莓枝枯病的病原菌較多，生產(chǎn)中需要引起高度重視。

田間病害調(diào)查是植物抗病性鑒定的重要方法之一，它具有鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、全面等優(yōu)點。但是，田間病害調(diào)查往往是在病圃或病害流行區(qū)進行。在本研究中，由于受藍莓品種栽培的限制，不同品種栽培在不同的藍莓果園中。因此，本研究中的田間病害調(diào)查結(jié)果，不可能準(zhǔn)確、全面的反映出各品種對枝枯病的抗病性，僅僅可用于初步判斷這些品種對藍莓枝枯病的抗病性程度。結(jié)合人工接種的抗病性鑒定，可以認為燦爛、杰兔2品種對棒狀擬盤多毛孢侵染藍莓引起的枝枯病具有一定程度抗病性。另外，由于引起藍莓枝枯病的病原菌的多樣性，本研究的抗病性鑒定結(jié)果，可能不一定適合于非棒狀擬盤多毛孢引起的藍莓枝枯病。