利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究

陳蘭濤 孫鑫 尹輝 姚亞飛 段寶民

利多卡因是一類鎮(zhèn)痛作用較好的酰胺類麻醉藥物，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)利多卡因可導(dǎo)致患者出現(xiàn)頭暈、低血壓及肢體功能障礙，因而利多卡因?qū)颊叩母弊饔萌找媸艿疥P(guān)注［1］。海馬主要由神經(jīng)干細(xì)胞聚集形成，參與學(xué)習(xí)、記憶及情緒等重要功能的調(diào)控。李順洪等［2］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制大鼠的學(xué)習(xí)及運(yùn)動(dòng)功能。游仁芳等［3］發(fā)現(xiàn)利多卡因可導(dǎo)致部分老年患者術(shù)后發(fā)生認(rèn)知功能障礙，可能由于利多卡因?qū)颊咧袠猩窠?jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性。目前利多卡因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的毒理機(jī)制尚不明確，本研究探討利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及相關(guān)作用機(jī)制，為進(jìn)一步改善臨床麻醉用藥提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞購自上海斯信生物科技有限公司，采用含10%胎牛血清及150 U/L 青霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾（Dulbecco's Modified Eagle's Mediium，DMEM）培養(yǎng)液，通過做濃度依賴實(shí)驗(yàn)確定利多卡因?qū)嶒?yàn)濃度，依據(jù)不同濃度利多卡因分為3 組，其中對(duì)照組給予0.9%生理鹽水處理，不加利多卡因，A 組加入1 μM 利多卡因，B 組10 μM 利多卡因。置于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基購自上海博升生物科技有限公司；Trizol 試劑購自美國(guó)invitrogen 公司；胰酶購自德國(guó)Sigma 公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司；mTOR、CyclinD1、Cleaved caspase3、GAPDH 一抗及HRP 標(biāo)記的二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；MDF-394 超低溫冰箱購自日本三洋公司；DYCP-31DN 電泳儀購自北京六一儀器廠；CyFlow Cube 流式細(xì)胞儀購自德國(guó)Partec公司；SW-CJ-1B 超凈工作臺(tái)購自上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；HH-CP-01P CO2培養(yǎng)箱購自上海皓莊儀器有限公司；Allegra 64R 高速離心機(jī)購自美國(guó)貝克曼公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 MTT 法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖能力

將海馬神經(jīng)細(xì)胞接種在96 孔板，細(xì)胞數(shù)量為1×104/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入生理鹽水，A組加入1 μM 利多卡因，B 組10 μM 利多卡因。置于37℃，5%CO2條件分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 d 后棄上清液，每孔加入10 μL MTT 溶液，孵育4 h 后棄上清液，每孔加入80 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），在450 nm波長(zhǎng)采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期

對(duì)照組給予0.9%生理鹽水處理，不加利多卡因，A 組加入1 μM 利多卡因，B 組10 μM 利多卡因。置于37℃，5% CO2條件培養(yǎng)24 h 后，以1 500 rpm 離心10 min 后經(jīng)預(yù)冷PBS 清洗，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，取0.5 mL 細(xì)胞懸液后加入預(yù)冷的70%乙醇固定6 h，以1 500 rmp 離心后棄上清液，經(jīng)預(yù)冷PBS 清洗后，加入1 mL 的PI 染色液，置于4℃條件避光孵育25 min，在488 nm 處采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期狀況。

1.5 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率

對(duì)照組給予0.9%生理鹽水處理，不加利多卡因，A 組加入1 μM 利多卡因，B 組10 μM 利多卡因。置于37℃，5% CO2條件培養(yǎng)24 h 后，經(jīng)預(yù)冷PBS 清洗，各組細(xì)胞加入300 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，然后加入10 μL Annexin VEGFP，孵育10 min 后加入10 μL PI，混勻后避光靜置10 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)mTOR、CyclinD1 及Cleaved caspase3 基因水平

對(duì)照組給予0.9%生理鹽水處理，不加利多卡因，A 組加入1 μM 利多卡因，B 組10 μM 利多卡因。置于37℃，5% CO2條件培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞后采用Trizol 法提取總RNA，經(jīng)RNA 質(zhì)檢合格后，通過RNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用Prime5.0 軟件設(shè)計(jì)基因引物，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，mTOR基 因：正 向 引 物5′- CGACTGCATGCATGCAC-3′，5′-CGACTGCATGTGCAC-3′；CyclinD1基因：正向引物5′-GCACGTGCA-GTAGCCAC-3′，5′-CGTGACTGCACTGATC-3′；Cleaved caspase3基因：正向引物5′-GTATGCAGTCACTGC-3′，5′-GCATGCAG TCGTCAGC-3′；GAPDH基因：正向引物5′-CTGACTGACGTCACGTC-3′，5′-GTACGTGCA-CT GCAGC-3′；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃25 s；95℃5 s，58℃30 s，72℃60 s，反應(yīng)32 個(gè)循環(huán)后，通過2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。mTOR基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為217 bp；CyclinD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為342 bp；Cleaved caspase3基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為249 bp；GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為273 bp。

1.7 Western blotting 檢 測(cè)mTOR、CyclinD1 及Cleaved caspase3 蛋白水平

對(duì)照組給予0.9%生理鹽水處理，不加利多卡因，A組加入1 μM利多卡因，B組10 μM利多卡因。置于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞后加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于4℃條件20 min后，以12 000 rpm離心10 min，收集上清液并采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣本液與上樣緩沖液混勻后，沸水浴5 min，待冷卻后上樣（每孔15 μg），采用10%的SDSPAGE 電泳，通過濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后采用含5%脫脂奶粉的封閉液孵育2 h，經(jīng)TBST 清洗3次后加入mTOR、CyclinD1、Cleaved caspase3和GAPDH的一抗，置于4℃孵育過夜，經(jīng)TBST液洗滌后，加入HRP 標(biāo)記的二抗，置于搖床晃動(dòng)2 h。采用TBST 液洗滌3 次后，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑顯色，曝光、拍照后采用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)Ω鹘M發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖能力的影響

通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第2 d 后A 組及B 組神經(jīng)細(xì)胞增殖水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；第2 d 后B組神經(jīng)細(xì)胞增殖水平顯著低于A 組（P＜0.05）。利多卡因可促使發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量下降、形態(tài)異常。見表1、圖1及圖2。

2.2 利多卡因?qū)Ω鹘M發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期影響

本研究發(fā)現(xiàn)利多卡因處理24 h 后，A 組及B 組的G0/G1 期細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組的G0/G1 期細(xì)胞比例顯著高于A 組（P＜0.05）；A 組及B 組的S 期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組的S 期細(xì)胞比例顯著低于A 組（P＜0.05）；A 組及B 組的G2/M 期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組的S 期細(xì)胞比例顯著低于A 組（P＜0.05）。見圖3。

表1 利多卡因?qū)Πl(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞增殖水平的影響Table 1 The effect of lidocaine on the proliferation of neurons during development

圖1 利多卡因?qū)Πl(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of lidocaine on proliferation of developing nerve cells

2.3 利多卡因?qū)Ω鹘M發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡影響

本研究發(fā)現(xiàn)利多卡因處理24 h 后，A 組及B 組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組細(xì)胞凋亡率顯著高于A 組（P＜0.05）。見圖4。

2.4 利多卡因?qū)Ω鹘M發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞mTOR、CyclinD1 及Cleaved caspase3 基因水平的影響

利多卡因處理24 h 后，A 組及B 組的mTOR、CyclinD1基因水平均低于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組的mTOR、CyclinD1基因水平低于A 組（P＜0.05）；A 組及B 組的Cleaved caspase3基因水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；B 組Cleaved caspase3基因水平顯著高于A 組（P＜0.05）。見圖5。

圖2 利多卡因?qū)Πl(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 2 Effects of lidocaine on the growth of neurons during development

2.5 利多卡因?qū)Ω鹘M發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞mTOR、CyclinD 1 及Cleaved caspase 3 蛋白水平的影響

利多卡因處理24 h 后，A 組及B 組的mTOR、CyclinD1 水平均低于對(duì)照組（P<0.05）；B 組的mTOR、CyclinD1 低于A 組（P<0.05）；A 組及B 組的Cleaved caspase 3 水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；B 組Cleaved caspase 3 水平顯著高于A 組（P<0.05）。見圖6。

3 討論

圖3 利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響Figure 3 Effect of lidocaine on cell cycle of cultured hippocampal neurons

圖4 利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率影響Figure 4 Effect of lidocaine on the apoptosis rate of hippocampal neurons during development

圖5 利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因水平的影響Figure 5 Effect of lidocaine on the level of related gene in hippocampus of developing hippocampal neurons

利多卡因是臨床應(yīng)用較為廣泛的麻醉藥物，具有起效快、麻醉效果好等特點(diǎn)，但其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的副作用日益受到關(guān)注，利多卡因可能影響神經(jīng)細(xì)胞的可塑性，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受損［4-6］。有臨床研究發(fā)現(xiàn)大劑量使用利多卡因可能導(dǎo)致手術(shù)患者發(fā)生神經(jīng)退行性病變，促使患者術(shù)后學(xué)習(xí)能力下降［7］。Patterson 等［8］研究發(fā)現(xiàn)小鼠視神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)8 μM 利多卡因作用12 h 后，細(xì)胞內(nèi)DNA 發(fā)生降解并出現(xiàn)凋亡小體，提示利多卡因可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。郭艷輝等［9］研究發(fā)現(xiàn)利多卡因麻醉可能導(dǎo)致患者發(fā)生馬尾綜合癥，從而造成患者神經(jīng)損傷。通常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中衰老神經(jīng)細(xì)胞將發(fā)生凋亡，有助于神經(jīng)祖細(xì)胞分化、成熟，從而保持神經(jīng)元維持正常的生理功能，但利卡多因的使用可能促使發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡率異常上升，對(duì)患者的記憶力及認(rèn)知功能等造成損傷。目前利多卡因在臨床應(yīng)用較廣，為降低利多卡因?qū)颊叩纳窠?jīng)毒性，探討利多卡因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞損傷的毒理機(jī)制有重要臨床價(jià)值。

圖6 利多卡因?qū)Πl(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)蛋白水平的影響Figure 6 Effect of lidocaine on the level of related protein in hippocampus of developing hippocampal neurons

本研究通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖能力，并且高濃度的利多卡因的抑制效果更強(qiáng)，導(dǎo)致G0/G1期神經(jīng)細(xì)胞比例上升，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。已有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可干擾發(fā)育期海馬神經(jīng)元的細(xì)胞周期，促使細(xì)胞G0/G1期進(jìn)入S 期，并且導(dǎo)致細(xì)胞停滯于S期［10-11］。這表明利卡多因抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制與丙泊酚存在差異，G0/G1期轉(zhuǎn)入S 期的控制蛋白主要為cyclin D1、CDK4 和CDK6 等周期蛋白，利卡多因可能抑制這幾類蛋白的活性，從而促使G0/G1期神經(jīng)細(xì)胞比例上升。細(xì)胞由S 期轉(zhuǎn)入G2/M 期主要受CDK1 激酶調(diào)控，丙泊酚對(duì)該類蛋白的活性產(chǎn)生干擾作用。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)利多卡因可促進(jìn)發(fā)育期的海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且B組的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平高于A 組。Western blotting 發(fā)現(xiàn)發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)利多卡因處理后cyclin D1 及mTOR 表達(dá)水平下降，提示利多卡因可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路干擾發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能。有研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制小鼠成纖維細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的激活，促使細(xì)胞生長(zhǎng)功能障礙，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升［12］。這表明利多卡因的細(xì)胞毒性與PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路密切相關(guān)，為研究如何緩解利卡多因的毒性提供了作用靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)利卡多因可促進(jìn)肺癌細(xì)胞內(nèi)p38MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)及翻譯，導(dǎo)致凋亡蛋白Caspase-3、Bax 水平異常，并最終促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［13-15］。這與本研究結(jié)果不一致，提示利多卡因的細(xì)胞毒性機(jī)理可能涉及多種信號(hào)通路，需要綜合分析利多卡因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡作用機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)利多卡因可抑制GAP-43 及p-GAP-43 等蛋白水平促使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架形成障礙，從而誘導(dǎo)神經(jīng)突起分支數(shù)量下降，并對(duì)促使神經(jīng)細(xì)胞突觸功能異常［16-17］。這說明利多卡因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制較為復(fù)雜，不僅可干擾神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡，同時(shí)可能對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，為了充分闡明利卡多因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的損傷，需進(jìn)一步分析其細(xì)胞的形態(tài)、其它關(guān)鍵代謝基因的影響，以期尋找可能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，利多卡因可抑制發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路有關(guān)，為治療利多卡因的神經(jīng)細(xì)胞毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。