注射用單硝酸異山梨酯細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究

曹霞飛 何華紅

（1 廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511405；2 廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510160）

注射用單硝酸異山梨酯（Isosorbide Mononitrate for Injection）是新一代長效硝酸酯類抗心絞痛藥物，為硝酸異山梨酯的主要活性代謝產(chǎn)物。本品主要釋放一氧化氮使環(huán)鳥苷酸（CGM）增加而致血管擴(kuò)張，降低肺動(dòng)脈高壓，減少回心血量，減輕心臟負(fù)荷，從而減少心肌耗氧量；同時(shí)還可通過提高血小板內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平抑制肺血管微血栓形成，降低肺循環(huán)阻力[1]，減輕心臟負(fù)荷，改善缺血區(qū)血流供應(yīng)。近年來，該藥物已廣泛應(yīng)用于心絞痛及充血性心力衰竭等心血管疾病的治療。本品尚未收載于中國藥典，國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（試行）YBH05182003對其藥物的質(zhì)量控制采用家兔法進(jìn)行熱原檢查；而國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-022）-2005Z中規(guī)定注射用單硝酸異山梨酯內(nèi)毒素限值為不大于3.2 EU/μg。本實(shí)驗(yàn)針對現(xiàn)有資料中，該藥物存在方法、標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一且限度偏低等問題進(jìn)行修訂，以考察其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性，并提出將其限度提高至更安全合理的范圍，力求降低其在臨床使用中的熱原反應(yīng)率。研究如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：恒溫水?。⊿W22型），德國Julabo公司；旋渦混合器（MSI型），廣州IKA公司。所用玻璃用具和耐熱材料置于熱空氣烤箱中經(jīng)250 ℃干熱2 h除去熱原。

1.2 試藥：注射用單硝酸異山梨酯（瑞陽制藥有限公司，規(guī)格：每瓶50 mg，批號(hào)：12043006；山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每瓶20 mg，批號(hào)：033120201；浙江普洛康裕制藥有限公司，規(guī)格：每瓶20 mg，批號(hào)：20100705B；海南新中正制藥有限公司，規(guī)格：每瓶50 mg，批號(hào)：120201；武漢華龍生物制藥有限公司，規(guī)格：每瓶25 mg，批號(hào)：20120503。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：批號(hào)：150601-201174，160 EU/支，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）規(guī)格：批號(hào)：1105060，50 mL/支，湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品。

1.5 鱟試劑（TAL）A：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：1202151，靈敏度（λ）：0.25EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支；鱟試劑（TAL）B：廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：110603，靈敏度（λ）：0.25 EU/mL，規(guī)格：0.1 mL/支。

2 方法與結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素限值（L）的確定[2]：注射用單硝酸異山梨酯臨床最大有效劑量為7毫克/次，依據(jù)劑量來確定，非經(jīng)腸道藥品的內(nèi)毒素限值L等于K/M，K是人每千克體質(zhì)量的內(nèi)毒素閾值，注射劑K=5 EU/（kg·h）；M是人每千克體質(zhì)量在1 h內(nèi)的最大注射劑量，按成人體質(zhì)量60 kg計(jì)算，根據(jù)“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”的要求安全系數(shù)定為3，經(jīng)計(jì)算得到注射用單硝酸異山梨酯的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為14 EU/mg。以此為依據(jù)，做以下可行性研究。

2.2 靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：按照中國藥典2015年版四部通則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，復(fù)核實(shí)驗(yàn)所用鱟試劑的靈敏度測試值（λc）是否在其標(biāo)示靈敏度（λ）的可接受范圍內(nèi)，根據(jù)不同廠家不同規(guī)格鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，在旋渦混合器上混勻30 min，分別制成2倍稀釋系列，即2λ、λ、1/2λ和1/4λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗(yàn)包括陰性對照。將溶液直接加入和等量容積（0.l mL）裝有凍干粉試劑的單次試管中，恒溫孵育一段時(shí)間[（37±1）℃，（60±2）min]，避免振動(dòng)，將每支試管按順序從恒溫器中直接取出并輕輕翻轉(zhuǎn)180°觀察結(jié)果，如果內(nèi)容物形成堅(jiān)實(shí)凝膠并在試管翻轉(zhuǎn)后保留在原處，則記為陽性；如果未形成完整的凝膠，則結(jié)果為陰性，最低濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的所有平行管都為陰性結(jié)果試驗(yàn)才為有效試驗(yàn)。

結(jié)果見表1，由表1可見，兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查，λc/λ均在0.5～2.0，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 干擾初篩試驗(yàn)[3]

2.3.1 最大有效稀釋倍數(shù)是樣品的最大允許稀釋倍數(shù)，在MVD下，內(nèi)毒素限值可以被判斷，此方法適應(yīng)于注射液或非經(jīng)腸道的以溶解或稀釋形式給藥的藥品溶液，MVD的計(jì)算公式如下：MVD=cL/λ，L=14 EU/mg，因此可計(jì)算出注射用單硝酸異山梨酯進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時(shí)，使用目前常用于藥品檢驗(yàn)的0.25～0.03 EU/mL的鱟試劑所對應(yīng)的最大有效稀釋倍數(shù)分別為56、112、224、448、896倍，對應(yīng)的最低有效濃度為0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 初篩試驗(yàn)：取5批注射用單硝酸異山梨酯，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度分別為0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL將以上系列濃度溶液標(biāo)記為供試品組（NPC），用上述梯度的BET水稀釋液作為溶劑，與4λ濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品等比混合的方法制備含有2λ濃度內(nèi)毒素的供試品，標(biāo)記此系列溶液為供試品陽性對照組（PPC），取靈敏度為0.25 EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，每一稀釋濃度制備兩管，同時(shí)按常規(guī)分別設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對照組（PC）和BET水陰性對照組（NC）各兩管，結(jié)果見表2。

表2 樣品干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果

從表2結(jié)果可見，所用的5批注射用單硝酸異山梨酯濃度稀釋到0.018 mg/mL或以下時(shí)，兩個(gè)廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)均未見增強(qiáng)或抑制的干擾作用。

2.4 干擾試驗(yàn)：用靈敏度為0.25 EU/mL，兩個(gè)不同廠家的鱟試劑按中國藥典2015年版四部通則的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，取不同廠家5批注射用單硝酸異山梨酯用BET水將樣品稀釋至0.018 mg/mL，用BET水和供試品稀釋液將對應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2λ、λ、1/2λ和1/4λ濃度的PPC系列和供試品稀釋液NPC系列，每一稀釋濃度平行4管，同時(shí)用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對照管，按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et），Es=lg-1（Xs/4），Et=lg-1（Xt/4），結(jié)果見表3。

從表3可知，5批注射用單硝酸異山梨酯用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋溶液對兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑測得的靈敏度在0.5λ～2.0λ，表明此濃度樣品溶液無干擾作用。

表3 樣品（終濃度為0.018mg/mL）干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：取5批注射用單硝酸異山梨酯，稀釋方法同2.4制成供試品溶液，使用λ=0.25 EU/mL的兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并用此稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2λ的溶液，作為供試品的陽性對照，另外以BET水建立陽性對照和陰性對照，按中國藥典2015年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果見表4。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

從表4結(jié)果可見，陰性對照組（NC）均為陰性，供試品陽性對照組（PPC）和陽性對照組（PC）均為陽性，實(shí)驗(yàn)有效；供試品組（NPC）均為陰性，表明樣品中所含細(xì)菌內(nèi)毒素未超過限度規(guī)定，5批注射用單硝酸異山梨酯的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討 論

本研究通過比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，確定供試品在某一濃度下是否對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有增強(qiáng)或抑制。采用了不同廠家共5批樣品與鱟試劑的相容性進(jìn)行篩查試驗(yàn)，確定其無干擾濃度范圍。將注射用單硝酸異山梨酯的0.036 mg/mL、0.018 mg/mL、0.009 mg/mL、0.0045 mg/mL、0.002 mg/mL稀釋液與批號(hào)為1202151，靈敏度0.25 EU/mL（由湛江安度斯生物有限公司提供）和批號(hào)為110603，靈敏度0.25 EU/mL（由廈門市鱟試劑廠有限公司提供），兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。內(nèi)毒素干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明注射用單硝酸異山梨酯為0.018 mg/mL或以下濃度稀釋液時(shí)對以上兩個(gè)廠家的鱟試劑無干擾作用。

隨后進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)，5批注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋液與以上兩批次鱟試劑（批號(hào)同干擾篩查試驗(yàn)）進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果對兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑均無干擾作用，Es/Et均在0.5～2.0，表明注射用單硝酸異山梨酯0.018 mg/mL稀釋液對以上兩個(gè)廠家鱟試劑無干擾作用。

研究表明，注射用單硝酸異山梨酯可按《中國藥典2015年版四部》通則第一法（凝膠法）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，確定限值為：14 EU/mg是可行的。