白藜蘆醇抑制TXNIP/NLRP3信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷

崔勇和，沈先敏

（襄陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽 441021）

隨著醫(yī)療技術(shù)不斷的革新，介入、多層螺旋CT及三維重建技術(shù)的普及，對比劑在診斷治療中的應(yīng)用越發(fā)受到重視。然而，對比劑致急性腎損傷（CIAKI）在臨床上出現(xiàn)的風(fēng)險也越來越高，為導(dǎo)致院內(nèi)腎功能衰竭的三大原因之一，僅次于腎臟灌注不足及腎毒性藥物，而CIAKI占據(jù)院內(nèi)獲得性腎功能衰竭的11%[1-2]。引起CIAKI發(fā)生發(fā)展的病因較多，其中對比劑引起腎臟微血管血流動力學(xué)改變、對比劑導(dǎo)致腎小管的毒性、氧化損傷、炎性反應(yīng)及腎小管梗阻等均會誘導(dǎo)CIAKI的發(fā)生[3-4]。其中炎性損傷可能是誘導(dǎo)CIAKI發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）在各種刺激下會引起NLRP3炎性通路的活化，誘導(dǎo)IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的釋放[5-6]；并且研究報道在急性腎損傷模型中TXNIP/NLRP3信號通路處于高度活化的狀態(tài)[7]。白藜蘆醇主要提取于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物，屬于一種天然的抗炎劑[8]，并且其具有明顯的降低蛋白尿及保護(hù)腎的藥理活性[9]。因此，本研究從細(xì)胞水平研究白藜蘆醇對人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎性損傷中的作用，并觀察其對TXNIP/NLRP3信號通路的影響。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 白藜蘆醇（湖北盛天恒創(chuàng)生物有限公司，批號：13065-54-8，純度≥99%）；人腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞由上海斯信科技生物有限公司提供（來源于美國ATCC細(xì)胞庫）；1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermoscientific公司（批號：R001100）；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司（批號：CK04）；LPS（批號 L2880，美國 Sigma公司）；IL-6、IL-1β 及TNF-αELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司（批號分別為：WK15204，WK25540，WK36640）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自武漢谷歌生物有限公司（批號：P57460）；兔抗鼠 β-actin（貨號 ab108267）、iNOS（貨號 ab152104）、COX-2（貨號 ab105217）、TXNIP（貨號 ab1520107）及 NLRP3（貨號 ab1663570）一抗均購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；

SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.3 HK-2細(xì)胞培養(yǎng) 采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細(xì)胞長滿至95%左右時用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 白藜蘆醇對HK-2細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化、離心、重懸后，以5×104個/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔加入200μL的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為5組：正常對照組、LPS誘導(dǎo)組、LPS+低劑量（50μmol/L）白藜蘆醇組、LPS+中劑量（100μmol/L）白藜蘆醇組、LPS+高劑量（200μmol/L）白藜蘆醇組，首先在藥物組中加入相應(yīng)濃度白藜蘆醇溶液，2 h后再加入LPS溶液。培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10μL CCK8試劑，孵育1 h后采用酶標(biāo)儀450 nm波長下OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算細(xì)胞相對存活率。

1.5 藜蘆醇對HK-2細(xì)胞炎性因子水平的影響將對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行消化重懸接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1．4”項(xiàng)分組及藥物處理24 h后收集細(xì)胞及細(xì)胞上清，細(xì)胞上清用于炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平檢測，其操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 藜蘆醇對HK-2細(xì)胞炎性蛋白及TXNIP/NLRP3信號通路的影響 將“1．5”項(xiàng)收集的細(xì)胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取50μg的蛋白上樣，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3抗體（體積稀釋比例均為1：1 000）4℃反應(yīng)過夜。次日以TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1：3 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0．05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對HK-2細(xì)胞相對存活率的影響 各組間HK-2細(xì)胞相對存活率比較見圖1，提示LPS誘導(dǎo)組HK-2細(xì)胞相對存活率顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導(dǎo)組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細(xì)胞相對存活率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能促使HK-2細(xì)胞增殖。

圖1 各組間HK-2細(xì)胞相對存活率的比較Fig.1 Comparison of the relative survival rate of HK-2 cellsin each group

2.2 白藜蘆醇對HK-2細(xì)胞上清炎性因子含量的影響 各組間HK-2細(xì)胞上清炎性指標(biāo)水平比較見表1所示，提示LPS誘導(dǎo)組HK-2細(xì)胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導(dǎo)組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細(xì)胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制細(xì)胞炎性因子的釋放。

表1 各組間HK-2細(xì)胞上清炎性因子水平比較（±s）Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levelsof HK-2 cellsin each group（±s）pg/mL

表1 各組間HK-2細(xì)胞上清炎性因子水平比較（±s）Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levelsof HK-2 cellsin each group（±s）pg/mL

注：與正常對照組比較，*P＜0．05；與 LPS 誘導(dǎo)組比較，#P＜0．05。

組別 IL-6 IL-1β TNF-α正常對照組 592．5± 85．4 58．1± 9．6 76．5± 9．6 LPS 誘導(dǎo)組 1 740．8±256．3*152．7±16．4*184．6±14．8*LPS+低劑量白藜蘆醇組 1 306．4±210．7#119．5±20．7#149．3±16．3#LPS+中劑量白藜蘆醇組 995．7±224．1# 86．3±15．2#116．7±11．7#LPS+高劑量白藜蘆醇組 706．2±168．5# 67．4±12．6# 84．2± 8．2#

2.3 白藜蘆醇對HK-2細(xì)胞炎癥蛋白iNOS及COX-2表達(dá)的影響 各組間HK-2細(xì)胞炎癥蛋白iNOS及COX-2表達(dá)水平比較見圖2所示，提示LPS誘導(dǎo)組HK-2細(xì)胞iNOS及COX-2表達(dá)水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細(xì)胞iNOS及COX-2表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制細(xì)胞炎性蛋白iNOS及COX-2的表達(dá)。

圖2 不同組間炎性蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of inflammatory proteinsexpression in deferent groups

2.4 白藜蘆醇對HK-2細(xì)胞中TXNIP/NLRP3信號通路的影響 各組間HK-2細(xì)胞TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)水平比較見圖3所示，提示LPS誘導(dǎo)組HK-2細(xì)胞TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；與 LPS 誘導(dǎo)組相比，低、中、高劑量白藜蘆醇組細(xì)胞TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），說明白藜蘆醇能抑制HK-2細(xì)胞TXNIP/NLRP3信號通路的活化。

3 討論

CIAKI會進(jìn)一步引起腎間質(zhì)纖維化，后者為多種腎臟疾病導(dǎo)致的腎臟功能進(jìn)行性惡化的重要過程，為各種腎臟病變發(fā)展到終末期腎衰竭的共同環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)在腎間質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷、間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)過度沉積等[10]。腎小管上皮細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下，能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，參與腎間質(zhì)纖維化。由于腎小管上皮細(xì)胞的存在，其轉(zhuǎn)分化過程的進(jìn)展程度對于腎臟病的預(yù)后至關(guān)重要。于是，探索有效抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的藥物對于改善腎臟疾病有著重要作用。

圖3 不同組間TXNIP及NLRP3蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of TXNIPand NLRP3 proteins expression in different groups

白藜蘆醇屬于一種天然的多酚醇類化合物，主要存在于葡萄籽、花生、虎杖等多種植物中，它對心血管、腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病都有保護(hù)作用。白藜蘆醇可以通過抑制氧化應(yīng)激損傷及炎性損傷保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟功能，其作用機(jī)制與激活Nrf2/Keap1信號通路有關(guān)[11]；細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)提示白藜蘆醇可通過活化Nrf2/ARE信號通路抑制腎臟系膜細(xì)胞的增殖[12]；還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性緩解早期大鼠的腎功能損傷[13]。然而白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用研究甚少，于是本研究觀察了白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖能明顯誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎性損傷，表現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著升高，細(xì)胞中炎癥蛋白iNOS及COX-2表達(dá)的顯著增高以及細(xì)胞相對存活率的明顯降低，提示脂多糖構(gòu)建的HK-2細(xì)胞炎性損傷模型是成功的。接著采用不同濃度白藜蘆醇干預(yù)HK-2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其能明顯誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖，并抑制炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的產(chǎn)生及炎性蛋白iNOS、COX-2的表達(dá)，說明白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性損傷具有顯著的保護(hù)作用。

炎性損傷在多種腎病的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用，多種刺激可使間質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子水平增高，使其處于炎性損傷狀態(tài)。然而炎性狀態(tài)下會誘導(dǎo)TXNIP與NLRP3的相互作用引起NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路的活化。并且NLRP3在糖尿病腎病及腎缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵性作用，于是降低炎性小體NLRP3的活化能抑制炎性反應(yīng)，可進(jìn)一步改善腎臟損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂多糖能明顯誘導(dǎo)TXNIP、NLRP3蛋白的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致炎性反應(yīng)；然而白藜蘆醇能明顯抑制TXNIP、NLRP3蛋白的表達(dá)，降低了TXNIP/NLRP3炎性信號通路的活化，從而達(dá)到抑制炎性反應(yīng)的藥理作用?？傊?，白藜蘆醇可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥損傷，抑制炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性通路活化相關(guān)。