ERCC1 Asn118Asn(rs11615)和ERCC2 Lys751Gln(rs13181)基因多態(tài)性與膽囊癌的關聯(lián)性研究

幸贊西,包昶宇

膽囊癌在臨床中較為少見，但惡性程度高。膽囊癌一般早期不易被發(fā)覺，并且容易發(fā)生轉移，對化療藥物不敏感。因此，臨床治療膽囊癌的常見方法是手術治療，早期手術能夠明顯提高病人預后，但研究表明膽囊癌病人術后的生存率為32%～61%，并且復發(fā)率高[1]。細胞內(nèi)DNA損傷與核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)機制密切相關，NER的能力可以明顯改善腫瘤病人的預后[2]。研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤病人及正常人群(ERCC)基因ERCC1Asn118Asn(rs11615)和ERCC2Lys751Gln(rs13181)在NER機制中具有重要功能。本次研究針對ERCC1和ERCC2基因多態(tài)性，探究其與膽囊癌病人預后的關系，旨在為同行提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇重慶市紅十字會醫(yī)院普外科2014年5月至2016年5月期間收治的50例膽囊癌病人為膽囊癌組，其中男性32例，女性18例，年齡范圍為45～68歲，年齡為(52.6±4.2)歲；另選擇50例同期健康體檢人員為對照組，其中男性35例，女性15例，年齡范圍為42～64歲，年齡為(49.3±3.8)歲。膽囊癌組與對照組在年齡和性別方面差異無統(tǒng)計學意義(t=0.323，P=0.754；χ2=0.534，P=0.764)，具有可比性。膽囊癌組病理類型：腺鱗癌4例、未分化癌3例、腺癌36例、鱗癌7例。膽囊癌Nevin分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期15例，Ⅲ期6例，Ⅳ期6例。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求,征得病人或其近親屬同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA提取 利用QIAGEN試劑盒(QIAamp DNA Blood MiniKit，USA,批號52304)提取肝素抗凝管內(nèi)靜脈血的DNA。

1.2.2引物合成ERCC1與ERCC2基因正向和反向的引物合成序列見表1，引物由北京華博生物技術有限公司合成。

1.2.3聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增 預變性95 ℃4 min、變性95 ℃30 s、退火56 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，72 ℃末延伸5 min；共35個循環(huán)，重蒸水(ddH2O)17 μL，PCR產(chǎn)物10 μL;水浴37 ℃酶切10 min，然后取出立即置水浴65 ℃滅活5 min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45 min，電壓設置為145 V。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用例(%)表示，各組間基因型和等位基因頻率比較采用Hardy-Weinberg檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因分型結果在ERCC1Asn118Asn(rs11615)中，對照組CC型33例，CT型13例，TT型4例；膽囊癌組CC型27例，CT型13例，TT型10例。在ERCC2Lys751Gln(rs13181)中，對照組AA型28例，AB型16例，BB型6例；膽囊癌組AA型10例，AB型22例，BB型18例。

2.2 ERCC基因型在膽囊癌組與對照組的分布由表2結果表明，兩組的ERCC1Asn118Asn(rs11615)的基因型頻率分布相比，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.05，P=0.028)。兩組的ERCC2Lys751Gln(rs13181)的基因型頻率分布相比，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.83,P=0.669)。ERCC1Asn118Asn(rs11615)的膽囊癌組與對照組等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.27，P=0.026)。ERCC2Lys751Gln(rs13181)的膽囊癌組與對照組等位基因型頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.75，P=0.448),結果見表3。

表2 ERCC1與ERCC2基因型頻率分布/例(%)

表3 ERCC1與ERCC2等位基因頻率分布/個(%)

2.3ERCC1、ERCC2多態(tài)性與膽囊癌的關系分析兩個基因的基因型與膽囊癌的關系時發(fā)現(xiàn),ERCC1的T與C等位基因比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.31，P=0.004)，而ERCC1的TT與CC基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.82，P=0.032)。ERCC2的AB與AA基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.31，P=0.025)，見表4。

3 討論

核苷酸切除修復(NER)作為修復DNA的途徑之一，可以為多重DNA損傷提供有效地修復幫助，同時也滿足體現(xiàn)出高度多態(tài)性的DNA損傷修復需要[3]。采用NER途徑可以對DNA、紫外線損傷起到高效地修復作用。但是研究也表明，借助該類途徑進行治療的病人，其體內(nèi)的ERCC1和ERCC2基因多態(tài)性在某種程度上會影響NER相關功能的發(fā)揮[4]。已有臨床研究中，大多數(shù)圍繞ERCC1基因展開的分析都是基于118位置C到T突變的這一層面[5-6],比如，相關研究人員選取了一部分非小細胞肺癌病人，并對這些病人體內(nèi)的ERCC1 Asn118Asn展開了相關分析，分析結果顯示，部分體內(nèi)檢測出CC基因型的病人(54/109,50.4%)生存時間大多為486 d左右(95%CI:333～523)，而變異型CT(45/109,42.1%)或TT(8/109,7.5%)生存時間則有了大幅度的縮小，時間多數(shù)為281 d(95%CI：214～376)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005 8)[5]。這直接說明了隨著DNA復和物清除數(shù)量的持續(xù)增加，順鉑耐藥性隨之改變，ERCC1和ERCC2水平也會發(fā)生變化。諸多資料都顯示NER基因會影響消化道腫瘤[7]、肺癌[8]、口腔癌[9]等病癥的病發(fā)和后續(xù)演變，同時會對病人臨床治療效果、后續(xù)細胞修復產(chǎn)生影響作用。但是有關膽囊癌NER基因的探討及相關文獻卻少之又少。

表1 ERCC1與ERCC2基因引物設計

表4 ERCC1和ERCC2基因多態(tài)性與膽囊癌的關系

結合分析結果可知，ERCC、ERCC1Asn118Asn(rs11615)、等位基因在分布上體現(xiàn)出一定的規(guī)律，且三種基因都指向膽囊癌這一病癥。除此之外，ERCC2Lys751GlnAB也同其病發(fā)存在關聯(lián)性。由此可以推斷出ERCC的基因多態(tài)性可以在一定程度上判定膽囊癌的發(fā)生，是細胞癌變和擴散的警示之一。在本研究中，筆者只圍繞ERCC1和ERCC2、等位基因展開其同膽囊癌病變的研究。隨著后續(xù)研究的深入，可以適當對樣本數(shù)量加以豐富化。從腫瘤細胞層面來說，其體現(xiàn)出來的DNA修復水平較高，這樣一來便會直接導致癌細胞數(shù)量的迅速增長，從而弱化了藥物的效用，不利于病人的治療。所以，如何準確而高效地對癌細胞進行標記和檢測控制，是評估和治療膽囊癌期間需要加以重點考慮的問題。借助檢測基因多態(tài)性的早期控制可以幫助醫(yī)生更好地了解病人體內(nèi)癌細胞的分布和增長情況，有助于病情的盡早控制。研究結果顯示ERCC1和ERCC2這兩個基因在一定程度上會影響膽囊癌的病發(fā)，主要兩者體現(xiàn)的多態(tài)性。另外ERCC1Asn118Asn(rs11615) TT、等位基因T和ERCC2Lys751Gln(rs13181) AB三者都會促使該癌癥的病發(fā)，這一特征可以運用到臨床檢測膽囊癌方面，以此來縮短膽囊癌檢測的時間跨度，為病人爭取更多的治療時間，提高治療效果。

綜上所述,膽囊癌病人腫瘤細胞中的ERCC1與ERCC2多態(tài)性與膽囊癌發(fā)生顯著相關,檢測其多態(tài)性對早期發(fā)現(xiàn)膽囊癌有一定價值。