引起血流感染的耐萬古霉素腸球菌基因型、毒力及MLST分型研究

楊靖嫻 劉雪凱 邵冬華 梁國威

近年來，腸球菌已從過去公認(rèn)的致病性低的腸道定植菌逐漸演變?yōu)橐鹪簝?nèi)感染的重要病原菌之一，可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、腹盆腔感染、泌尿生殖系統(tǒng)和皮膚軟組織等多部位感染。耐萬古霉素腸球菌 (vancomycin-resistant enterococci，VRE) 自20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)后，迅速蔓延至整個(gè)美國、歐洲及全世界，加劇了腸球菌感染的治療難度[1,2]。研究顯示，在世界范圍內(nèi)由腸球菌引起的菌血癥約占全部病原菌的10%，病死率達(dá)25%～50%[3]。在美國，18%的導(dǎo)管相關(guān)血流感染的病原菌為腸球菌，而VRE所致菌血癥的病死率是萬古霉素敏感腸球菌所致菌血癥的2.5倍[4]。

在筆者醫(yī)院由腸球菌引起的血流感染占全部病原菌的7%，排名第5位(前4位依次為凝固酶陰性葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌)。了解引起血流感染的VRE菌株的耐藥基因型和分子流行病學(xué)特征可為VRE的預(yù)防和控制提供重要依據(jù)。本研究收集了2012年7月～2015年7月期間航天中心醫(yī)院檢驗(yàn)科血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中分離的68株屎腸球菌和28株糞腸球菌作為研究對(duì)象，調(diào)查VRE的檢出情況，并對(duì)其進(jìn)行耐藥基因型、毒力基因和多位點(diǎn)序列分型 (multilocus sequence typing，MLST)研究。

材料與方法

1.菌株來源：收集自2012年7月～2015年7月期間從筆者醫(yī)院檢驗(yàn)科血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中分離的68株屎腸球菌和28株糞腸球菌作為研究對(duì)象，全部菌株均為患者首次入院首次分離株。所有菌株于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.儀器與試劑：哥倫比亞血瓊脂平板、MH瓊脂平板以及萬古霉素和替考拉寧的E-test試條均為法國生物梅里埃生物有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增試劑購于北京天根生化科技有限公司；全部引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC51299購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。Vitek全自動(dòng)微生物分析儀購自法國生物梅里埃公司；PCR System 9700購自美國ABI公司；Alpha Innotech凝膠成像儀；電泳儀購自美國Bio-rad公司。

3.菌株確認(rèn)和VRE篩選：全部菌株復(fù)蘇后經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行重新鑒定和藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC29212。采用含6μg/ml萬古霉素的腦心浸液平皿篩選VRE，點(diǎn)種5μl濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木海?7℃溫箱孵育24h，有菌落生長者為VRE。萬古霉素敏感菌株對(duì)照為糞腸球菌ATCC29212，萬古霉素耐藥菌株對(duì)照為糞腸球菌ATCC51299。

4.VRE的耐藥表型測(cè)定：采用E-test法檢測(cè)篩選出的VRE對(duì)萬古霉素和替考拉寧的最低抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration，MIC)，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015CLSI-M100-S25文件[5]。

5.細(xì)菌DNA提?。禾羧⊙桨迳辖?jīng)純培養(yǎng)后的VRE菌落適量，置入裝有200μl 去離子水的1.5ml離心管中，混勻。100℃煮10min，迅速4℃冷卻20min，12000r/min離心5min，取上清液作模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.耐藥基因檢測(cè)：采用本課題組之前報(bào)道的多重PCR法檢測(cè)vanA、vanB及糞腸球菌和屎腸球菌特異的ddl基因片段(ddl-efa、ddl-efm)，該法能同時(shí)檢測(cè)菌株耐藥基因以及在基因水平上進(jìn)行菌種鑒定[6]。

7.毒力基因檢測(cè)：目前，研究較多并認(rèn)為與腸球菌致病性相關(guān)的因子主要包括腸球菌表面蛋白 (enterococcal surface protein，esp)、透明質(zhì)酸酶 (hyaluronidase，hyl)、明膠酶 (gelatinase，gelE)、聚集物質(zhì) (aggregation substance，asa1) 和溶細(xì)胞素 (cytolysin，cylA)[7～9]。采用本課題組之前報(bào)道的多重PCR法檢測(cè)上述5種毒力基因在糞腸球菌和屎腸球菌之間的分布頻率及特征。

8.多位點(diǎn)序列分型 (MLST)：根據(jù)已建立的MLST分型方法，分別對(duì)屎腸球菌 (adk、atpA、ddl、gdh、gyd、purK、pstS) 和糞腸球菌 (gdh、gyd、pstS、gki、xpt、aroE、yiqL)的7個(gè)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序分析，反應(yīng)條件及引物序列參考MLST網(wǎng)站 (http:∥www.mlst.net)。所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，并通過MLST數(shù)據(jù)庫 (http:∥www.mlst.net) 和 eBURST v.3 軟件(http:∥eburst.mlst.net) 進(jìn)行序列型 (sequence type，ST) 和克隆復(fù)合群 (clonal complex，CC)的比對(duì)分析。

結(jié) 果

1.菌株確認(rèn)和藥物敏感度：經(jīng)Vitek 2 compact微生物分析儀和種特異性基因雙重鑒定后，從筆者醫(yī)院血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中共收集到96株腸球菌，其中屎腸球菌68株(68/96, 70.8%)，糞腸球菌28株(28/96, 29.2%)。所有菌株對(duì)11種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1，其中屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率分別為88.2%和35.7%，對(duì)萬古霉素的耐藥率分別為29.4%和7.1%，提示屎腸球菌比糞腸球菌更易產(chǎn)生耐藥株。多數(shù)菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物大部分表現(xiàn)為耐藥，但對(duì)利奈唑烷和替加環(huán)素均為敏感。糞腸球菌對(duì)奎奴普汀/達(dá)福普汀天然耐藥，而屎腸球菌對(duì)奎奴普汀/達(dá)福普汀的耐藥率為零。

表1 血標(biāo)本中分離的96株腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥性

2.VRE篩選結(jié)果：經(jīng)VRE篩選確認(rèn)后，共檢出22株VRE，包括20株屎腸球菌 (29.4%，20/68) 和2株糞腸球菌 (7.1%，2/28)。全部菌株分布于不同科室，其中老年病科和血液科分布最多，詳見表2和表3。

3.VRE耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果：表型檢測(cè)結(jié)果顯示，22株VRE對(duì)萬古霉素高度耐藥，MIC均 ≥ 256μg/ml，對(duì)替考拉寧呈現(xiàn)不同水平耐藥，MIC介于 16～256μg/ml。基因型檢測(cè)結(jié)果顯示，22株VRE均為vanA基因型，未檢測(cè)出vanB基因。所有VRE耐藥表型與基因型一致，屬高水平耐藥[8]。結(jié)果見表2和表3。

4.VRE毒力基因檢測(cè)結(jié)果：20株屎腸球菌VRE僅檢測(cè)到esp (16/20，80.0%) 和hyl (10/20，50.0%) 兩種基因，其余3種均未檢出；且10株hyl陽性菌株中，僅1例單獨(dú)陽性，其余9例均與esp聯(lián)合陽性。兩種基因的4種分布模式檢出情況分別為esp+/hyl+(9/20,45.0%),esp+/hyl-(7/20,35.0%),esp-/hyl-(3/20,15.0%)和esp-/hyl+(1/20,5.0%)。這種分布規(guī)律與本課題組前期報(bào)道的結(jié)果基本一致[5]。結(jié)果見表2。5種毒力基因在2株糞腸球菌VRE中的分布情況見表3，僅gelE和asa1陽性。其分布規(guī)律有待提高樣本量后進(jìn)一步研究。

5.VRE菌株MLST分型結(jié)果：經(jīng)MLST和eBURST進(jìn)行同源性分析后，20株屎腸球菌VRE共分為7個(gè)ST型，其中ST78 (8/20，40.0%) 和ST17 (6/20，30.0%) 為優(yōu)勢(shì)型別，其余6株分別為2株ST18型和 ST389、ST414、ST571、ST564型各1株；7種ST型均屬于同一個(gè)克隆復(fù)合群CC17。2株糞腸球菌VRE為ST6型，屬于CC2。結(jié)果見表2和表3。值得一提的是，8株ST78屎腸球菌VRE中，有5株的毒力基因分布模式為esp+/hyl-，占62.5%；6株ST17屎腸球菌VRE中，有5株的毒力基因分布模式為esp+/hyl+，占83.3%。這種特征未見其他文獻(xiàn)報(bào)道，有待提高樣本量后進(jìn)一步確認(rèn)。

表2 20株耐萬古霉素屎腸球菌的表型、基因型、毒力基因和MLST分型結(jié)果

van.萬古霉素；TEI.替考拉寧；ST.序列型；CC.克隆復(fù)合群

表3 2株耐萬古霉素糞腸球菌的表型、基因型、毒力基因和MLST分型結(jié)果

van.萬古霉素；TEI.替考拉寧；ST.序列型；CC.克隆復(fù)合群

討 論

VRE的出現(xiàn)和迅速增多已成為全球公共衛(wèi)生的重要威脅。在美國，屎腸球菌VRE的分離率已從1980年的0增長到2007年的80%，而糞腸球菌VER的分離率不到7%。歐盟耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2011年的數(shù)據(jù)顯示屎腸球菌VRE和糞腸球菌VRE在29個(gè)國家的平均檢出率分別為7.2%和1.0%，但不同國家間屎腸球菌對(duì)萬古霉素的耐藥率差異很大，最高可達(dá)34.9%。2010年澳大利亞耐藥工作組的數(shù)據(jù)顯示其屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)萬古霉素的不敏感度分別為36.5%和0.5%[9]。2015年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng) (CHINET) 數(shù)據(jù)顯示，糞腸球菌對(duì)萬古霉素耐藥率為0.8%，屎腸球菌對(duì)萬古霉素耐藥率為2.9%，其中耐藥率最高的是北京市，達(dá)到11.2%[10]。而筆者醫(yī)院屎腸球菌VRE和糞腸球菌VRE的分離率分別高達(dá)29.4%和 7.1%，遠(yuǎn)高于全國平均水平(表1)。基于以上背景，本研究對(duì)2012年7月～2015年7月期間分離自筆者醫(yī)院血培養(yǎng)標(biāo)本中的22株VRE進(jìn)行耐藥基因型、毒力基因和MLST分析，以期為應(yīng)對(duì)VRE感染提供支持和參考。

目前，根據(jù)耐藥性連接酶結(jié)構(gòu)基因的主要序列不同，將VRE分為vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN共9種耐藥基因型，其中van (A、B、D、G、L、M和N) 屬于獲得性耐藥，而vanC和vanE屬先天性耐藥。上述不同基因型在不同地區(qū)不同時(shí)期流行率不盡相同，醫(yī)院內(nèi)流行的主要是vanA和vanB型，vanA型對(duì)萬古霉素和替考拉寧均耐藥，vanB型對(duì)萬古霉素耐藥而替考拉寧敏感[8,9,11]。本研究中全部VRE菌株均為vanA型，占主導(dǎo)地位，與國內(nèi)外報(bào)道一致[9,11,12]。CHINET在2014年可分型的101株VRE中，共檢出vanA、vanB和vanM 3種基因型，分別占37.6%、39.6%和22.8%[13]。VanM型自2006年于上海一所教學(xué)醫(yī)院首次分離后，逐漸在上海地區(qū)占據(jù)主導(dǎo)地位，但在我國其他地區(qū)和其他國家仍未見報(bào)道，可能與目前的檢測(cè)技術(shù)多針對(duì)vanA和vanB型，而未針對(duì)vanM型有關(guān)[11,12]。本研究所用方法亦未檢測(cè)vanM型，北京和上海人員交流往來頻繁，極有可能發(fā)生vanM型的傳播，提示在今后研究中應(yīng)重視vanM型VRE的檢測(cè)。

MLST技術(shù)是一種基于核酸序列測(cè)定的基因分型方法，選用6～10個(gè)管家基因 (多數(shù)為7個(gè)) 進(jìn)行序列分析，通過序列的變化反映菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，具有較高的分辨率，可通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)共享及比對(duì)，且該法具有一套標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)，在不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性較好，已廣泛用于細(xì)菌基因分型研究[14]。應(yīng)用MLST技術(shù)對(duì)屎腸球菌和糞腸球菌進(jìn)行同源性分析已非常成熟，研究發(fā)現(xiàn)，存在與醫(yī)院內(nèi)感染密切相關(guān)的克隆復(fù)合群，屎腸球菌為CC17，糞腸球菌為CC2和CC9[9,15]。屬于CC17的屎腸球菌具有如下特征：①對(duì)氨芐西林和喹諾酮類藥物高水平耐藥；②可通過獲得vanA或vanB基因?qū)θf古霉素產(chǎn)生耐藥；③大多數(shù)攜帶esp和(或)hyl毒力基因；④上述耐藥和毒力基因可在細(xì)菌間水平傳播。因此，CC17群屎腸球菌可高度適應(yīng)醫(yī)院內(nèi)環(huán)境，引起全球范圍內(nèi)廣泛流行，應(yīng)引起高度重視[15]。本研究的MLST結(jié)果顯示，20株屎腸球菌VRE共檢出7個(gè)ST型，且均屬于CC17，以ST78 (8/20，40.0%) 和ST17 (6/20，30.0%) 為優(yōu)勢(shì)型別，與國內(nèi)外報(bào)道一致[15,16]。本研究僅檢出2株糞腸球菌VRE，MLST分型為ST6 (CC2)，并未檢出亞洲流行型別ST4 (CC4)[9]。由于糞腸球菌對(duì)萬古霉素的耐藥率較低，對(duì)該類菌株分子特征的研究資料有限，有待于擴(kuò)充樣本量后進(jìn)一步研究。

VRE已成為院內(nèi)感染的重要致病菌，臨床感染以糞腸球菌和屎腸球菌多見。盡管臨床上腸球菌屬感染具有一些共性，但越來越多的研究者認(rèn)為，屎腸球菌和糞腸球菌具有不同的感染模式。有研究發(fā)現(xiàn)，由屎腸球菌引起的血流感染比糞腸球菌引起的血流感染具有更高的病死率，這與屎腸球菌對(duì)萬古霉素耐藥率高有密切關(guān)系[17]。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)VRE耐藥機(jī)制和分子特征的研究，為預(yù)防和控制VRE的感染和傳播提供數(shù)據(jù)支持。