32例智力低下發(fā)育遲緩患兒基因組拷貝數(shù)變異的分析

黨穎慧 宋婷婷 萬陜寧 鄭蕓蕓 黎 昱 陳必良 張建芳

兒童智力低下(mental retardation，MR)和發(fā)育遲緩(developmental delay，DD)是一類嚴(yán)重危害兒童健康的疾病，發(fā)生率約為 2.3%[1]。在我國導(dǎo)致智力低下的先天性因素中，遺傳病約占 40.5%，而染色體因素占遺傳因素的 37.0%[2]。染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)是一種全新的分子核型分析技術(shù)，具有敏感度高、分辨率高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳性疾病和正常人群中能檢測出各種基因拷貝數(shù)變化，應(yīng)用CMA對(duì)CNVs進(jìn)行深入研究是國內(nèi)外研究該病遺傳機(jī)制的發(fā)展趨勢，但國內(nèi)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)仍有限[3]。本研究應(yīng)用CMA對(duì)32例不明原因的MR/DD患兒進(jìn)行全基因組掃描與分析，探討CMA對(duì)不明原因MR/DD患兒可能的分子病因診斷的作用。

對(duì)象與方法

1.篩選標(biāo)準(zhǔn):選擇2015年1月～2017年11月到筆者醫(yī)院兒科及遺傳咨詢門診就診的患兒32例為本次調(diào)查對(duì)象，選擇標(biāo)準(zhǔn)包括：①臨床診斷為智力低下/發(fā)育遲緩患兒；②無明顯圍生期異常病史，無明確出生后缺氧、中毒、頭顱外傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等病史；③無甲狀腺功能異常，無顱內(nèi)腫瘤；④常規(guī)染色體核型正常；⑤排除已知的遺傳性綜合癥和遺傳性代謝病導(dǎo)致的智力低下。其中男性患兒14例，女性患兒18例，患兒年齡2個(gè)月～10歲，主要表現(xiàn)為智力低下、生長發(fā)育遲緩、特殊面容等。根據(jù)不同的年齡段分別采用《Gesell發(fā)育量表》和《中國韋氏智力量表》測定兒童的發(fā)育商(DQ)或智商(IQ)，同時(shí)運(yùn)用《嬰兒-初中生社會(huì)適應(yīng)性能力量表》進(jìn)行社會(huì)適應(yīng)性能力評(píng)價(jià)。IQ或DQ<70，伴社會(huì)適應(yīng)性能力低下者診斷為MR，5歲稱為MR，<5歲稱為DD；以下統(tǒng)稱為MR/DD。告知所有患兒監(jiān)護(hù)人CMA的檢測范圍及局限性，簽署書面知情同意書。本研究獲得筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.檢測方法：皮膚表面常規(guī)消毒后抽取靜脈血2ml，使用 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)按說明書操作方法提取基因組DNA。應(yīng)用Affymetrix公司的Cytogenetic CytoScan 750K Array全基因芯片掃描技術(shù)檢測全基因組CNVs。Affymetrix CytoScan 750K Array芯片包含有20萬SNP標(biāo)記和55萬CNV標(biāo)記，以平均大約1marker/4kb的密度分布于人類的整個(gè)基因組，用于檢測全基因組染色體。按試劑盒說明書操作：將DNA溶解于AE buffer 溶液并將DNA 濃度調(diào)整至50ng/μl。對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切、連接、PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠法進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行片段化處理，片段在25～125bp。片段化后的產(chǎn)物在末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記完成后和雜交試劑混合，95℃ 10min，49℃孵育2min后取200μl樣本載入到置密的芯片中，密閉50℃，60r/min雜交16～18h。然后將芯片放入洗染工作站內(nèi)完成洗滌、SAPE染色等步驟。洗染結(jié)束后將芯片放入掃描儀進(jìn)行掃描。用Affymetrix GeneChip Scaner生成原始cel文件通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析，利用CHAS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

3.CMA檢測結(jié)果判定:對(duì)于檢測出的CNVs通過與公共數(shù)據(jù)庫UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER、OMIM等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析判斷其性質(zhì)，結(jié)果分為：①致病性CNVs；②意義不明確CNVs；③意義不明確，可能致病CNVs；④意義不明確，可能良性CNVs；⑤良性CNVs[4]。

結(jié) 果

1.32例MR/DD患兒的染色體拷貝數(shù)異常情況:在32例不明原因的MR/DD患兒中，共檢出16例存在CNVs，臨床表現(xiàn)詳見表1。其中致病性CNVs 8例(25%，8/32)，意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，意義不明確、可能良性CNVs 2例(6.3%，2/32)。

表1 16例MR/DD患兒臨床表現(xiàn)

表2 CMA檢出的8例致病性CNVs結(jié)果對(duì)比

2.16例患兒CNVs結(jié)果分析:16例患兒中存在CNVs，8例為致病性CNVs，陽性率25%，其中存在缺失6例，重復(fù)1例，重復(fù)合并缺失1例，所檢出的CNVs大小為(0.22～17.00)Mb；3例確診為已知綜合征患兒，分別是1q21.1缺失綜合征(1q21.1 deletion syndrome)，瓦登伯格綜合征(Waardenburg syndrome)，史密斯-馬吉利綜合征(Smith-Magenis syndrome)，詳見表2。意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，其中缺失2例，重復(fù)1例，雜合性缺失3例，所檢出的CNVs大小為(0.42～19.50)Mb，>10Mb的片段有6個(gè)，詳見表3。另外意義不明確，可能良性有2例。

表3 CMA檢出的意義不明確CNVs結(jié)果對(duì)比

討 論

智力障礙是一類遍及全世界的嚴(yán)重危害兒童身心健康的一類疾患，初步估計(jì)目前約15%～20%的智力障礙是由于亞顯微的染色體拷貝數(shù)變異造成的。國外研究已證實(shí)在不明原因MR/DD患者中10%～20%存在基因組不平衡，并認(rèn)為這種基因組失衡是MR/DD甚至神經(jīng)精神疾患的致病原因之一[5]。G顯帶染色體核型分析作為首選技術(shù)已廣泛用于染色體異常的檢測，但是其分辨率有限，而CMA能夠在全基因組水平進(jìn)行掃描，尤其是對(duì)于檢測染色體組微小缺失及重復(fù)等不平衡性重排具有突出優(yōu)勢，2010年細(xì)胞分子遺傳學(xué)芯片國際標(biāo)準(zhǔn)(International Standard CytogenomicArray，ISCA) 協(xié)會(huì)在研究了21698例具有異常臨床表征，包括智力低下、發(fā)育遲緩、多種體征畸形以及自閉癥的先證者的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)CMA對(duì)致病性CNV的檢出率為12.2%，比傳統(tǒng)G顯帶核型分析技術(shù)的檢出率提高了10%。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)建議，將CMA作為生長發(fā)育遲緩、智力低下和孤獨(dú)癥譜系疾病的一線診斷技術(shù)，而不再使用傳統(tǒng)的顯帶核型分析技術(shù)[6]。

本研究應(yīng)用CMA檢測不明原因MR/DD患兒32例，檢測出16例患兒存在CNVs，其中8例發(fā)現(xiàn)致病性CNVs，陽性率25%(8/32)。利用CMA在兒科遺傳病的臨床應(yīng)用專家共識(shí)中針對(duì)智力落后和(或)發(fā)育遲緩患者進(jìn)行CNVs檢測，陽性率約為19.2%，二者數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致[7]。

在32例患兒中，病例1至病例8檢測結(jié)果為致病性CNVs。病例1檢出9號(hào)染色體9q22.33q31.3區(qū)域有約12.4Mb的缺失，9q22.32q32區(qū)域約17Mb的嵌合缺失，該缺失區(qū)域包含多個(gè)OMIM基因，數(shù)據(jù)庫顯示可能與特殊面容、牙齒發(fā)育不全，小腦畸形，聽力受損相關(guān)，此外4號(hào)染色體4q35.2區(qū)域約680kb的缺失，但沒有OMIM基因，有病例報(bào)道該區(qū)域的缺失與克羅恩病相關(guān)，染色體4q缺失綜合征是一種罕見的疾病(1∶100000的發(fā)生率)，具有不同的臨床表型，取決于涉及的區(qū)域，其包括發(fā)育遲緩和異型[8]。4q33區(qū)域已被提議為4q缺失綜合征的關(guān)鍵區(qū)域，而涉及4q34～4q35的更遠(yuǎn)端缺失與輕度畸形、表型和智力障礙有關(guān)[9]。病例2檢出12號(hào)染色體12p13.33p12.3區(qū)域有約16.7Mb的重復(fù)，13號(hào)染色體13q34區(qū)域3.6Mb的缺失。12p13.33p12.3區(qū)域含有RAD52、WNK1和HSN2等178個(gè)OMIM基因，Decipher數(shù)據(jù)庫顯示該區(qū)域的重復(fù)可能與發(fā)育遲緩，智力低下相關(guān)。

13q缺失綜合征(OMIM:613884)是以生長發(fā)育遲緩、智力障礙、先心病和癲癇為特征的染色體病癥，不同區(qū)域不同位置臨床表現(xiàn)不同，長臂末端13q33～34，主要與嚴(yán)重的智力障礙相關(guān)，此13q34區(qū)域3.6Mb的缺失包含18個(gè)OMIM基因，Decipher數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)顯示該區(qū)域缺失與語言障礙、發(fā)育遲緩、先心病及智力低下等臨床癥狀有關(guān)[9,10]。病例3檢出1號(hào)染色體1q21.1q21.2區(qū)域有約1.99Mb的缺失，該缺失區(qū)域包含13個(gè)OMIM基因，且與OMIM數(shù)據(jù)庫中的1q21.1缺失綜合征(1q21.1 deletion syndrome，OMIM:612474)有重疊區(qū)域，有文獻(xiàn)提示該區(qū)域缺失患者與喂養(yǎng)困難、生長發(fā)育遲緩、智力低下、小頭畸形等臨床表現(xiàn)相關(guān)。1q21.1缺失綜合征患者表現(xiàn)多樣化，大多患者伴有輕到重度的發(fā)育遲緩，先天性多發(fā)畸形[11]。病例4檢出2號(hào)染色體2q35q36.1 區(qū)域有約5.8Mb的缺失，該區(qū)域包含PAX3、DES、EPHA4等52個(gè)OMIM基因，ISCA、Decipher、Clinvar等數(shù)據(jù)庫顯示該缺失具有致病性，與語言發(fā)育遲緩、智力低下、先心病等有關(guān)。該缺失區(qū)域包含PAX3基因，此基因的缺失或突變會(huì)引起瓦登伯格綜合征(Waardenburg syndrome，OMIM:193500)，它是一種臨床罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為皮膚、毛發(fā)和眼睛的色素異常、感覺神經(jīng)性耳聾及其他畸形等臨床表現(xiàn)。有報(bào)道該基因缺失與先心病也有關(guān)[12]。

此外2q33.2q37.3區(qū)域有約36Mb的嵌合缺失。病例5檢出17號(hào)染色體17p11.2區(qū)域有約3.1Mb的缺失，包含COPS3、NT5M、RAI1等31個(gè)OMIM基因，該缺失區(qū)域與史密斯-馬吉利綜合征(Smith-Magenis syndrome，OMIM:182290)區(qū)域有重疊，包含的劑量敏感型RAI1基因?yàn)樵摼C合征的關(guān)鍵基因，Decipher、ISCA、Clinvar等數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)顯示該區(qū)域缺失的患者大多數(shù)伴有智力低下、睡眠障礙、自我傷害行為、語言表達(dá)能力障礙、牙齒異常等臨床表現(xiàn)[13,14]。病例6檢出18號(hào)染色體18q22.2q23區(qū)域有約10.8Mb的缺失，該缺失區(qū)域包含GALR1、MBP、TSHZ1等24個(gè)OMIM基因，Clinvar、Decipher、OMIM等數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)顯示該區(qū)域缺失的患者可能有發(fā)育遲緩、顱面部異常、身材矮小、張力減退、語言表達(dá)能力障礙、聽力損傷、腭裂等臨床表現(xiàn)[15]。病例7檢出20號(hào)染色體20q11.21q11.23區(qū)域有約6.4Mb的重復(fù)，該重復(fù)區(qū)域包含ASXL1、DNMT3B、EPB41L1等68個(gè)連續(xù)的OMIM基因，Decipher、ISCA、Pubmed等數(shù)據(jù)庫顯示該區(qū)域重復(fù)較為罕見，但有該區(qū)域重復(fù)致病的病例報(bào)道，該區(qū)域重復(fù)的患者可能有發(fā)育遲緩、內(nèi)眥贅皮、顱面部異常、語言表達(dá)能力差等臨床表現(xiàn)[16]。病例8檢出2號(hào)染色體2q24.3區(qū)域有約222 kb的缺失，該缺失區(qū)域包含SCN3A和SCN2A 2個(gè)OMIM基因，這兩個(gè)基因均為鈉離子通道α亞基基因家族成員，SCN2A基因雜合突變或缺失與癲癇性腦病及自閉癥相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示該區(qū)域缺失的患者可能有癲癇、自閉癥、神經(jīng)系統(tǒng)異常、精神阻滯、小頭畸形等臨床表現(xiàn)[17,18]。

本研究32例患兒中，檢測出意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，意義不明確、可能良性CNVs 2例(6.3%，2/32)。其中病例9～病例14結(jié)果為意義不明CNVs，病例15和病例16結(jié)果為意義不明確、可能良性CNVs，因?yàn)槿笔^(qū)域包含著絲粒位置且探針較少。病例9檢出Y染色體Yq11.223q11.23區(qū)域約2.2Mb的缺失，Yq11.23區(qū)域約885kb的缺失，該缺失區(qū)域與國際公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫(DGVs)不重疊，包含DAZI、DNZ2等OMIM基因，該區(qū)域的缺失可能與男性生殖細(xì)胞的發(fā)育與無精癥相關(guān)。病例10檢出X染色體Xp11.23p11.1約11.4Mb的缺失，該區(qū)域含有133個(gè)OMIM基因，致病性尚不明確。病例11檢出9號(hào)染色體9q33.3有約420kb的缺失，該區(qū)域包含2個(gè)OMIM基因，致病性不明確。14號(hào)染色體14q11.2有約434kb的缺失，該區(qū)域無OMIM基因。病例12檢出多條染色體大于10Mb的缺失，但這些缺失區(qū)域包含多個(gè)隱性致病基因，臨床意義尚不明確，雜合性缺失會(huì)增加隱性遺傳病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。病例13檢出Y染色體Yq11.223q11.23、Yq11.23區(qū)域分別有約1.21Mb、1.35Mb的重復(fù)，該重復(fù)區(qū)域與DGVs數(shù)據(jù)庫不完全重疊，共包含7個(gè)OMIM基因，但Decipher、Clinvar 等數(shù)據(jù)庫顯示該區(qū)域重復(fù)的臨床意義尚不明確。病例14檢出4號(hào)染色體4q21.21q22.1區(qū)域有約12Mb的雜合性缺失，該區(qū)域是否攜帶與遺傳印記相關(guān)的基因尚不明確，但包含的隱性致病基因會(huì)增加隱性遺傳病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于CNV的臨床意義不明確，可能是致病性，也可能是良性，即還沒有足夠的證據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)其臨床意義，其結(jié)果的解釋很具有挑戰(zhàn)性，可通過對(duì)雙親的進(jìn)一步檢測來明確，如果該CNV來自其沒有表型的雙親，則良性的可能性大，而如果是新發(fā)的，則致病的可能性更大。但本研究中意義不明確的病例因?yàn)槠渌驔]有進(jìn)行雙親的檢測。

CMA可在全基因組范圍進(jìn)行高分辨率掃描，不僅能檢出染色體不平衡性變異，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數(shù)變異。缺點(diǎn)是在正常人類基因組中廣泛存在沒有臨床意義的良性CNV/常見 CNV。CMA目前最大問題是對(duì)結(jié)果的正確解讀，其原因在于該技術(shù)能找出約1%的不確定性的拷貝數(shù)變異，這會(huì)給遺傳咨詢帶來一定的困擾，即使CMA存在上述一些缺點(diǎn)，但CNV檢測仍具有顯著優(yōu)勢，其臨床應(yīng)用價(jià)值不可低估[19]。由于正常人CNVs數(shù)據(jù)庫還不完善導(dǎo)致部分檢測到的CNVs臨床意義判斷困難，所以本研究中有6例患者目前僅能判斷意義不明CNVs。另外2例缺失區(qū)域包含著絲粒位置且探針較少，可能為良性。

CNVs相關(guān)的微缺失或微重復(fù)是不明原因MR/DD的主要病因，但是如何發(fā)現(xiàn)和評(píng)估罕見致病性CNVs已成為目前一個(gè)面臨挑戰(zhàn)的重要任務(wù)，評(píng)估因素主要包括：①是否在正常人群中有報(bào)道；②是否為新生CNVs；③CNVs長度是否足夠大；④是否在數(shù)據(jù)庫中有報(bào)道，且攜帶者具有RR/DD表型。這些CNVs無法被染色體核型分析所識(shí)別，CMA可提高對(duì)不明原因MR/DD患兒的分子病因診斷水平，對(duì)進(jìn)一步研究MR/DD病因機(jī)制具有重要意義，也可為患兒預(yù)后和家庭再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行指導(dǎo)。