芥菜類蔬菜種子休眠破除技術(shù)的研究

孫蕾 ，姚培杰 ，劉旭佳 ，徐玉穎 ，向世標(biāo) ，徐躍進(jìn) ，劉素君 ，萬正杰

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070；2.十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院）

芥菜是一種常異花授粉植物，屬于十字花科蕓薹屬作物，是起源于我國(guó)的特色蔬菜。芥菜有16個(gè)變種，主要包括葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜以及薹用芥菜等[1]。目前，我國(guó)的芥菜類蔬菜種植面積接近100萬hm2，全國(guó)各地均有栽培，其中西南、華南、華中、華東等15個(gè)省份是主產(chǎn)區(qū)，不僅栽培種類多，而且具有規(guī)?；纳a(chǎn)基地[2，3]。

芥菜既是重要的鮮食蔬菜，也是重要的農(nóng)副加工產(chǎn)品。由于芥菜種植歷史悠久、消費(fèi)者喜愛，芥菜類蔬菜品種或加工產(chǎn)品具有鮮明的地方特色，在全國(guó)各地形成了芥菜名特優(yōu)產(chǎn)品或者地理標(biāo)志產(chǎn)品，如涪陵榨菜、水東芥菜、惠州梅菜、宜賓芽菜、華容芥菜、襄陽(yáng)孔明菜等[2]。

種子休眠是指有生活力的種子在適宜的溫度、水分、氧氣等萌發(fā)條件下仍不發(fā)芽的現(xiàn)象[4，5]。導(dǎo)致種子休眠的原因概括起來分為2類：一類是內(nèi)源因素即胚本身的因素，包括胚的形態(tài)發(fā)育未完成、生理上未成熟、缺少必須的激素或存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)；另一類是外源因素即胚以外的各種組織，即種殼（種皮、果皮或胚乳等)的限制，包括種殼的機(jī)械阻礙、不透水性、不透氣性以及種殼中存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)等[6]。

為打破芥菜種子休眠現(xiàn)象，前人取得較多的研究進(jìn)展。魏安榮[7]為打破莖用芥菜新種休眠，對(duì)種子分期進(jìn)行了不同時(shí)間的低溫處理，并證明低溫處理下，隨著處理時(shí)間的后移，打破休眠的顯著效果逐漸提高；韓海霞[8]對(duì)沙芥研究發(fā)現(xiàn)，用0.1%～0.2%的KMnO4或50 mg/L的GA水溶液浸種6 h，25℃催芽處理，能明顯提高處于休眠期種子的發(fā)芽率；李廣昌等[9]證明了芥菜種子收獲后有一段后熟階段，直接曬干存在休眠期，但隨著種子貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，可自然解除休眠，低溫處理對(duì)促進(jìn)休眠狀態(tài)下芥菜種子萌發(fā)影響很大，且10℃冷藏處理效果大于5℃和0℃冷凍處理；嚴(yán)冬暉[10]指出一些芥菜種子采用1～5℃低溫處理4～7 d，配合0.2%的硝酸鉀浸芽是一種最為簡(jiǎn)便有效的打破休眠方法。

近年來，隨著芥菜類蔬菜種植面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，部分芥菜種子的休眠問題使芥菜的播種質(zhì)量下降、生產(chǎn)季節(jié)延誤、易產(chǎn)生種子糾紛，成為制約芥菜類蔬菜種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要影響因素。因此，本文以芥菜類蔬菜的主要變種為研究對(duì)象，通過比較試驗(yàn)篩選具有休眠現(xiàn)象的變種，再通過低溫處理和變溫處理技術(shù)，尋求有效破除芥菜類種子休眠的最佳技術(shù)方案，促進(jìn)芥菜類蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究利用的試驗(yàn)材料分別為：17W20（結(jié)球芥菜自交系種子，2017年采收和2018年采收后30 d）、17W64（莖瘤芥菜自交系種子，2017年采收和2018年采收后30 d）、17W119 （大頭菜自交系種子，2017年采收和2018年采收后30 d）、17W170 （大葉芥菜自交系種子，2017年采收和2018年采收后 30 d）、17W306（小葉雪里蕻自交系種子，2017年采收和2018年采收后30 d）。以上芥菜變種材料均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)十字花科蔬菜遺傳育種課題組（圖1）。

1.2 試驗(yàn)方法

將2018年采收后保存30 d的5個(gè)不同類型的芥菜種子分別進(jìn)行5 d晾曬，后取部分種子于常溫下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，即分別取各樣品種子50粒均勻放置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，3次重復(fù)，加蓋，并作相應(yīng)標(biāo)記，每日觀察調(diào)整水分、溫度狀況并記錄發(fā)芽情況，以芥菜完成后熟（2017年采收）的種子為對(duì)照（CK1～CK5），判斷存在休眠情況的芥菜類型。

后再取休眠類型2018年采收種子進(jìn)行低溫處理，即分別置于4℃冰箱內(nèi)低溫處理3、5、7 d；變溫處理，即將部分干燥種子與播入濕潤(rùn)培養(yǎng)皿的吸濕種子先置于4℃冰箱內(nèi)16 h，后放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中8 h，重復(fù)變溫操作3 d。以上材料經(jīng)處理后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，均以常溫處理下的各類型2018年采收種子為對(duì)照（CK），判斷芥菜發(fā)芽最佳處理?xiàng)l件。

計(jì)算各類型種子不同處理下的發(fā)芽率，并用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

發(fā)芽率=發(fā)芽試驗(yàn)終期（7 d）正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 2018年采收種子與完成后熟種子發(fā)芽試驗(yàn)對(duì)比

未經(jīng)處理的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，2018年采收后30 d的種子中，莖瘤芥菜自交系17W64和大頭菜自交系17W119 7 d發(fā)芽率高達(dá)100%，分蘗芥菜自交系17W306 7 d發(fā)芽率最低，為57.63%，結(jié)球芥菜自交系17W20和大葉芥菜自交系17W170的發(fā)芽率較高，達(dá)85%以上。發(fā)芽率數(shù)值經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，以完成后熟的各芥菜變種種子在正常發(fā)芽處理下發(fā)芽率為對(duì)照，進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，大葉芥菜自交系17W170與其對(duì)照（CK4），分蘗芥菜自交系17W306與其對(duì)照（CK5）間均有顯著差異；結(jié)球芥菜自交系17W20、莖瘤芥菜自交系17W64與大頭菜自交系17W119與其各自對(duì)照之間無顯著差異。因此，正常發(fā)芽條件下，對(duì)主要的不同芥菜變種進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)球芥菜自交系17W20、莖瘤芥菜自交系17W64與大頭菜自交系17W119同完全后熟的種子相比，不存在休眠問題；大葉芥菜自交系17W170雖存在休眠情況，但發(fā)芽率高于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用種子所要求的80%，一般不影響正常農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；分蘗芥菜自交系17W306存在明顯的休眠現(xiàn)象，種子的生理生化和后熟過程仍然在進(jìn)行（表1）。

圖1 5個(gè)芥菜變種的種子粒形

2.2 17W170與17W306低溫處理下的發(fā)芽率

對(duì)休眠明顯的大葉芥菜自交系17W170與分蘗芥菜自交系17W306進(jìn)行了種子低溫3、5、7 d處理的發(fā)芽率檢測(cè)，并進(jìn)行雙因素方差分析，利用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。結(jié)果顯示，2種芥菜種子在低溫處理3 d與5 d后其發(fā)芽率與常溫處理的 2018 年采收后 30 d 的種子（CKA1、CKA2）相比都有不同程度提高，以17W306低溫處理3 d后發(fā)芽率與對(duì)照相比，提高程度最大，約為32%。整體看來，低溫處理中以低溫處理3 d的發(fā)芽率平均值最高，并且處理后結(jié)果與完成后熟的種子發(fā)芽率結(jié)果相比無極顯著差異。因此，在低溫處理方式下對(duì)大葉芥菜自交系17W170與分蘗芥菜自交系17W306進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，雖然低溫處理3 d與5 d均可提高種子發(fā)芽率，但以低溫處理3 d結(jié)果為優(yōu)（表2）。

2.3 17W170與17W306變溫處理下的發(fā)芽率

對(duì)休眠明顯的大葉芥菜自交系17W170與分蘗芥菜自交系17W306進(jìn)行了干燥種子與吸濕種子變溫處理下的發(fā)芽率檢測(cè)，并進(jìn)行雙因素方差分析，利用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。結(jié)果顯示，2種芥菜種子在干燥狀態(tài)下進(jìn)行變溫3 d處理后其發(fā)芽率與常溫處理的2018年采收后30 d的種子（CKB1、CKB2）相比有所提高，以 17W306 低溫處理3 d后發(fā)芽率與對(duì)照相比，提高程度最大可達(dá)約34%，并且處理后結(jié)果與完成后熟的種子發(fā)芽率結(jié)果相比無極顯著差異。因此，在變溫處理方式下對(duì)大葉芥菜自交系17W170與分蘗芥菜自交系17W306進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，對(duì)干燥種子進(jìn)行3 d變溫處理得到的結(jié)果為優(yōu)（表3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 芥菜變種類型與發(fā)芽率

表1 完成后熟種子與采收30 d種子發(fā)芽率對(duì)比

表2 17W170與17W306低溫處理下種子發(fā)芽率的雙因素方差分析

表3 17W170與17W306變溫處理下種子發(fā)芽率的雙因素方差分析

芥菜種子良種繁育時(shí)，大部分芥菜變種的后熟時(shí)間一般為3個(gè)月左右[10]，國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)要求入庫(kù)保存種子的初始發(fā)芽率一般應(yīng)高于90%，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的種子發(fā)芽率一般要求高于80%，由于芥菜在我國(guó)不同季節(jié)均可栽培，因此為了確保芥菜種子的播種質(zhì)量和實(shí)時(shí)播種，應(yīng)該對(duì)具有休眠特性的芥菜變種進(jìn)行破除休眠處理。本研究基于芥菜不同變種材料的開花期和采收期相同的情況下，以上1個(gè)生產(chǎn)周期采收的完成后熟的各對(duì)應(yīng)類型芥菜種子為對(duì)照。發(fā)芽試驗(yàn)顯示，大葉芥菜自交系17W170與其對(duì)照，分蘗芥菜自交系17W306與其對(duì)照均有極顯著的差異。大葉芥菜自交系17W170與龍芥1號(hào)同為大葉芥菜變種，在研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)龍芥1號(hào)采用吸濕后低溫保存1～3 d可明顯提高發(fā)芽率[9]，對(duì)大葉芥菜自交系17W170干種子在4℃低溫下處理3 d可明顯提高發(fā)芽率，由此可以推測(cè)，低溫處理可以較好地破除大葉芥菜的休眠狀態(tài)。雪里蕻屬于分蘗芥菜變種，采收1個(gè)月后小葉雪里蕻有明顯的休眠特性，對(duì)其干燥種子進(jìn)行變溫處理可明顯提高發(fā)芽率；北移莖用芥菜在北方自繁過程中休眠期延長(zhǎng)[7]，同為莖用芥菜的常規(guī)莖瘤芥菜品種17W64卻不存在休眠現(xiàn)象。綜上可以推測(cè),在芥菜不同變種進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了不同的基因型，其中部分為適應(yīng)生存環(huán)境保留了休眠特性，但也有部分芥菜變種產(chǎn)生了完全不同于原品種的體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，在生產(chǎn)中體現(xiàn)出完全不同的種子發(fā)芽狀態(tài)。

3.2 不同因素處理與發(fā)芽率

本研究結(jié)果證實(shí)了2種處理（低溫處理中的低溫3 d處理及變溫處理中的干燥種子變溫處理）可明顯提高芥菜類種子發(fā)芽率。低溫處理為破除種子休眠的普遍方法，以煙草種子為例，前人研究證實(shí)在干種子狀態(tài)下對(duì)種子進(jìn)行低溫破除休眠與種子吸濕狀態(tài)下進(jìn)行低溫破除休眠相比，所需的時(shí)間更長(zhǎng)[11]。利用變溫處理提高種子發(fā)芽率在很多植物上取得成功，如煙草、黃瓜和番茄等，但在芥菜破除休眠研究中，利用變溫處理的試驗(yàn)較少，變溫處理又分為吸濕種子變溫處理和干燥種子變溫處理[11，12]，就本研究而言，干燥狀態(tài)下的變溫處理明顯優(yōu)于對(duì)吸濕種子進(jìn)行變溫處理。通常認(rèn)為，種子經(jīng)過變溫處理后能使胚芽的原生質(zhì)黏度發(fā)生適應(yīng)低溫的變化，原生質(zhì)的持水力增強(qiáng)，能增強(qiáng)喜溫蔬菜秧苗的抗寒力，使種子發(fā)芽粗壯，并可加快生長(zhǎng)發(fā)育速度，使生育期提早[12]，而對(duì)喜冷涼的十字花科作物也可以起到提高種子發(fā)芽率的作用，其內(nèi)在機(jī)理還有待于進(jìn)一步挖掘，調(diào)節(jié)機(jī)制仍待探索。

3.3 芥菜休眠機(jī)制的研究與芥菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展

造成種子休眠的原因比較復(fù)雜，一般有種胚尚未成熟、種被、抑制物質(zhì)、不適宜條件的影響等[13]。芥菜種子的休眠經(jīng)一段時(shí)間的后熟可破除，而使用一些處理手段，如改變溫度或激素浸種等，可以提前破除種子休眠。由破除休眠的現(xiàn)象難以判斷芥菜種子所屬的休眠類型及造成休眠的體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，故需進(jìn)一步探索。目前研究中已知miRNA作為生物體內(nèi)一類重要基因調(diào)控因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，可以通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控介導(dǎo)種子休眠與萌發(fā)[14]，但其調(diào)控機(jī)理也仍有待進(jìn)一步探究。

本研究中，體現(xiàn)休眠特性的芥菜均屬于葉用芥菜，葉用芥菜是十字花科蕓薹屬芥菜種中以葉或葉球?yàn)楫a(chǎn)品的變種，其中包含大葉芥菜與分蘗芥菜等[15]。大葉芥菜以發(fā)達(dá)的葉片及其葉柄供食用，是我國(guó)重要的加工和鮮食蔬菜，以其獨(dú)特的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛[16]，而葉用芥菜種子休眠使得芥菜播種受阻，盲目播種會(huì)造成生產(chǎn)資源的浪費(fèi)及巨大的經(jīng)濟(jì)損失。芥菜自古以來便是人們必不可少的家常菜，現(xiàn)今更是成為我國(guó)出口的名特產(chǎn)品，體現(xiàn)了芥菜市場(chǎng)廣大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。因此，探索芥菜種子休眠機(jī)制，從而打破種子休眠，提高種子發(fā)芽率與種子活力，提高成苗率，增加種子的實(shí)際種用價(jià)值，保證種子的質(zhì)量，進(jìn)而減少種子質(zhì)量事故的發(fā)生，保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的安全[17]，為芥菜類蔬菜種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了重要技術(shù)保障和研究基礎(chǔ)。